分子印迹固相萃取/液-质谱联用法测定烟熏鲟鱼中苯并芘

林亚楠 李诗言 崔益玮 戴志远，3 陈 康，3 王 扬 沈 清，3*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产质量检测中心 杭州310023 3 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012）

鲟鱼（A.sinensis）又名鲟龙，是世界上最大的淡水鱼类，其肉质鲜美细腻，营养丰富，具有巨大的加工潜力[1]。目前我国水产品养殖技术规模已经达到国际领先水平，鲟鱼养殖产量占世界总产量的80%，成为我国重要的淡水经济鱼类之一[2]。鲟鱼加工产品种类相对较少，市场认知度低，除了鱼卵用于生产高价值的鱼子酱外，鱼体主要用于生产冰鲜鲟鱼、速冻鲟鱼丸、烟熏鲟鱼片等[3-5]。鲟鱼肉经烟熏后具有特有的颜色和香味，然而也会从熏烟中引入有害物质[6]。虽然目前液熏法能有效避免稠环芳烃等化合物，但是其风味无法与烟熏法比拟[7]。

苯并芘（Benzopyrene）又称苯并（a）芘，它可损伤DNA，造成细胞癌变，对内脏和神经系统造成损伤，是一种致癌性很强的化合物[8]。3，4-苯并芘（3，4-BaP）是所有稠环芳烃中最具代表性的一种，其致癌作用明显高于其它稠环芳烃，小剂量就有可能引起局部组织的癌变，也可引起大鼠外周血淋巴细胞DNA、肺细胞和肝细胞损伤，因此成为人们关注的热点[9]。水产品中BaP 的来源主要包括原料污染和加工过程污染，如养殖水污染造成BaP 在生物体内富集，烧烤、烟熏、烘烤时受高温影响发生裂解与热聚合等反应形成[10]。我国《GB 2762-2005 食品中污染物限量》明确规定，食用油标准不超过10 mg/kg，熏烤肉不超过5 mg/kg，粮食不超过5 mg/kg，限量要求与欧盟、世卫组织制定的标准一致[11]。

目前烟熏水产品中的3，4-BaP 提取主要包括正己烷等有机溶剂液-液萃取法[12]、中性氧化铝富集净化法[13]、无机/有机复合材料固相微萃取法[14]等前处理方法。检测方法主要有气相色谱质谱法（GC-MS）[15]、高效液相色谱法（HPLC）[16]、液相色谱质谱法（LC-MS/MS）[17]、酶联免疫吸附法（ELISA）[18]等，其中GB/T22509-2008 和国际标准化方法ISO 15302-2007 推荐的固相萃取结合HPLC 法在生产实践中残留检测应用相对较广泛[19-20]。然而，该方法存在着3，4-BaP 特异性不强、灵敏度低等问题，难以满足人们对食品安全的要求[21]。另外，烟熏水产品中含有较多小分子杂质，对3，4-BaP 的测定不利，要求更精细的前处理过程和更优的色谱分离条件[22]。

本试验拟针对3，4-BaP 结构特征合成特异性固相萃取吸附填料，建立烟熏鲟鱼中3，4-BaP 的分子印迹固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱联用测定方法，以期对市场上烟熏鲟鱼产品进行监测，为职能部门提供相关试验依据，进而为消费者食品安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3，4-BaP 标准品 （纯度≥99%，美国Sigma Aldrich 公司），以甲醇为溶剂分别配置3，4-BaP标准储备液（10 μg/mL），临用时以基质提取液将标准溶液稀释为系列标准工作液；柱套和筛板取自去填料的商品化6 mL 固相萃取柱，美国Waters公司；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国TEDIA 公司；试验用水为Milli-Q 高纯水；甲苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、4-乙烯基吡啶、3-氨丙基三乙氧基硅烷、三乙胺、偶氮二异丁腈（AIBN）等试剂均为化学纯或分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters Acquity 系列超高效液相色谱仪，美国Waters 公司；4000 Qtrap 三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX 公司；Multi Reax 全能型振荡器，德国Heidolph 公司；Allegra X-12 高速离心机，美国BECKMAN 公司；5427R 台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；Milliplus 2150 超纯水处理系统，美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 3，4-BaP 提取 将烟熏鲟鱼去骨去皮后，取可食用肌肉组织搅碎并斩拌均匀成烟熏鲟鱼糜；称取5 g 样品，加入50 mL 乙腈-丙酮混合提取液（3∶2，V/V）后振荡使混合均匀；将混合物转移至离心管中，加入过量的氯化钠，以8 000 r/min 离心15 min；取上清液转移至干净的离心管，于-70℃静置30 min 后迅速于-20 ℃冷冻离心；将上清液在40 ℃下旋转蒸发至干，以2 mL 正己烷复溶，置于4 ℃保存。

1.3.2 分子印迹填料合成 向蒸馏瓶中加入100 g 硅胶，用体积分数10%的HCl 回流10 h，用蒸馏水洗涤至中性，得到活化硅胶干燥后备用；取5 g 活化硅胶和50 mL 无水甲苯放入圆底烧瓶中，加入2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和1 mL 三乙胺，加热回流24 h，将反应后的表面硅烷化硅胶过滤，使用甲醇、二氯甲烷洗涤并干燥；取0.5 mmol苯并芘（模板分子）溶解于5 mL 甲醇和15 mL 二氯甲烷，加入2 mmol 功能单体4-乙烯基吡啶，2 g硅烷化硅胶，低温振荡3 h，使混合充分；加入7.5 mmol 交联剂EGDMA 和0.1 g 引发剂AIBN，排出空气后于50 ℃反应48 h，洗涤后干燥备用。

1.3.3 固相萃取 称取3，4-BaP 分子印迹聚合物500 mg 混合悬浮在二氯甲烷中，填装到6 mL 的固相萃取空柱中，上端再加入筛板，压紧制成分子印迹固相萃取柱。

依次用5 mL 二氯甲烷和正己烷活化BISPE柱；将2 mL 提取液缓慢流经柱体，使提取液中的3，4-BaP 与填料充分结合；使用10 mL 正己烷淋洗；真空负压抽干后，使用5 mL 二氯甲烷将BISPE 上的3，4-BaP 洗脱，收集液再40 ℃下氮气吹干，用1 mL 乙腈定容，过0.22 μm 亲水PTFE 滤膜，待测。继续使用5 mL 二氯甲烷淋洗BISPE 柱3 次，经检测无目标物洗出，小柱可以重复使用20次以上。

1.3.4 液相色谱条件 液相色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），配套保护柱VanGuard BEH C18 （5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A 为甲醇，B 为超纯水；流速：0.60 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱条件：0～4 min，70%～95%A；4～6 min，95%A；6～8 min，95%～70%A；8～10 min，70%A。

1.3.5 质谱条件 大气压化学电离（APCI）离子源，正离子扫描方式多离子反应监测（MRM）；离子化电压（IS）：5 500V，离子源温度（TEM）：600℃，气帘气（CUR）：40 psi，喷雾气（GS1）：50 psi，碰撞气（CAD）：medium；其余质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 BaP 分子印迹材料表征

由图1可见，利用分子印迹技术制备的3，4-BaP 分子印迹固相萃取填料是一种球状颗粒，其外径在20～90 μm 不等，颗粒间分散性较强，以此填充的固相萃取柱具备较优的多路径效应和径向轴向扩散效应，较低的固定相和流动相间的传质阻力。

图1 不同放大倍率下的3，4-BaP 分子印迹聚合物的扫描电镜图Fig.1 SEM of 3，4-BaP molecular imprinted polymer

2.2 固相萃取条件优化

试验过程中发现，直接使用有机溶剂提取烟熏鲟鱼中3，4-BaP 时，提取溶液中的基质干扰物较多，基质效应造成的信号噪音较强烈，对色谱柱和质谱仪均产生不利的影响。烟熏鲟鱼样品中主要是大分子蛋白质，小分子脂肪和碳水化合物等。采用分子印迹固相萃取并对萃取条件进行优化，可有效富集样品中的3，4-BaP，去除干扰物。

2.2.1 不同填料比较 试验首先比较了极性分配固相萃取柱（Waters Sep-pak C18 500 mg/6 mL）、亲水亲脂平衡固相萃取柱（Waters Oasis HLB，150 mg/6 mL），Florisil（Strata FL-PR Florisil，1 000 mg/6 mL）和分子印迹固相萃取柱（500 mg/6 mL）。分别考察5，10 和50 μg/kg 三浓度水平下的加标回收率来评价这4 种固相萃取柱对3，4-BaP 的萃取效率。结果如图2所示，三浓度水平下，BISPE 的萃取效率均显著高于其它固相萃取柱，Sep-pak SPE 次之，HLB 和Florisil 相对较差。3 种浓度水平下，各固相萃取柱表现基本稳定。因此，本试验采用BISPE 为3，4-BaP 富集净化方法。

2.2.2 淋洗条件优化 3，4-BaP 分子印迹固相萃取在富集烟熏鲟鱼提取物中痕量残留目标物时可能存在非特异性吸附，因此本试验通过优化淋洗条件，最大限度地提高分子印迹填料结合位点和3，4-BaP 分子之间的选择性作用，去除非特异性作用和基质干扰。本试验分别以甲醇、乙腈、正己烷作淋洗液，测定空白烟熏鲟鱼提取液中不同浓度3，4-BaP 加标回收率。结果如图3，甲醇和乙腈选择性不佳，经其淋洗后的3，4-BaP 回收率分别为81.5%和87.4%，均会造成一定量3，4-BaP 的损失；正己烷选择性较好，能有效去除脂类等有机杂质，保留分子印迹对3，4-BaP 的吸附性能。

2.2.3 洗脱条件优化 洗脱溶剂必须破坏目标物与分子印迹填料结合位点间的作用，从而获得高富集因子。本试验比较了几种常用的SPE 洗脱剂，包括甲醇、乙腈、二氯甲烷和正己烷，结果见图3。甲醇和乙腈是最为常用的洗脱剂，然后其对3，4-BaP 的洗脱效果均不是太理想，回收率≤90%；而正己烷洗脱效果最差，仅为69.3%；二氯甲烷与3，4-BaP 相似相溶性最佳，洗脱效果最佳，3，4-BaP 回收率达到96.4%。

图2 不同固相萃取柱在3 个浓度水平下对3，4-BaP的萃取效率的影响Fig.2 The effect of SPE sorbent on the recovery of 3，4-BaP under three concentrations

图3 不同淋洗液和洗脱液对3，4-BaP的回收率的影响Fig.3 The effect of washing and eluting solvents on the recovery of 3，4-BaP

2.3 质谱条件优化

质谱条件是影响方法灵敏度的关键因素之一[23-25]。由于3，4-BaP 为弱极性化合物，在电喷雾离子（ESI）源中不易电离，信号响应较低，可在大气压化学电离源（APCI）中以正离子的方式电离。使用针泵注射器以10 μL/min 的流速将10 μg/kg的3，4-BaP 标准溶液注入离子源中，在APCI 正离子检测方式下对质谱测定条件进行优化。Q1 扫描时可见[M+H]+分子离子峰m/z 为253.2，以分子离子峰进行子离子扫描 （Product ion scan，PIS），得到丰度较高的碎片离子信息，如m/z 224.1 和m/z 226.1 等。然后再对离子源温度、去簇电压（Declustering potential，DP）、碰撞能量（Collision energy，CE）等参数进行优化，使离子对信号达到最佳。根据2002/657/EC 确证分析需要4 个识别点，故选择两对分子离子对，同时设定合适的峰驻留时间确保色谱峰的采样点数为12～18 点，从而得到较好的定量重复性。

表1 3，4-BaP 色谱质谱参数Table 1 The parameters of mass spectrometry for the detection of 3，4-BaP

图4 分子印迹固相萃取/液质联用检测3，4-BaP色谱图（50 μg/kg）Fig.4 The chromatogram of 3，4-BaP using molecular imprinted solid-phase extraction/ultra-performance liquid chromatography （50 μg/kg）

2.4 方法验证

取适量3，4-BaP 标准溶液，采用空白基质溶液配制成6 种质量浓度的标准工作溶液，以3，4-BaP 色谱图的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x，μg/kg）为横坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程y=3 726x+1 233.5，线性范围5～1 000 μg/kg，和相关系数0.9998。同时，采用标准添加法进行测定，分别根据3 和10 倍信噪比（S/N）确定被测物的方法检出限（LoD）和定量限（LoQ）。结果表明，3，4-BaP 的线性良好，检出限和定量限分别为0.98 和3.16 μg/kg，满足3，4-BaP 高灵敏度检测的需要。在空白烟熏鲟鱼样品中添加3，4-BaP 标准溶液，制备成含量分别为5，10 和50 μg/kg 的加标样品，按上述前处理方法及测定条件进行精密度和回收率试验，每个添加水平做6 次平行测定。结果如表2所示，三浓度水平下3，4-BaP 的日内精密度和日间精密度的相对标准偏差分别为3.26%～4.77%和3.78%～5.26%，该试验方法重现性较强；3，4-BaP 的方法回收率为89.7%～95.3%，RSD 为2.89%～3.44%，回收率较高，符合痕量分析的要求。

表2 3，4-BaP 分子印迹固相萃取/液质联用法的灵敏度、精密度和回收率Table 2 The sensitivity，accuracy，and recovery of 3，4-BaP using BISPE based UPLC-MS/MS

2.5 烟熏鲟鱼中3，4-BaP 含量测定

采用本试验建立的分子印迹固相萃取/液质联用法对市售30 批次烟熏鲟鱼和20 批次课题组研发的烟熏鲟鱼进行检测，并对结果进行数理统计分析。结果发现50 个批次烟熏鲟鱼中，共计12个样品检出3，4-BaP 为阳性，检出率为24%，除了1 批次烟熏鲟鱼3，4-BaP 含量达21.9 μg/kg 以外，其余批次烟熏鲟鱼中虽有3，4-BaP 阳性信号，但是低于定量限，符合国际限量标准。

3 结论

本试验建立了检测烟熏鲟鱼中3，4-BaP 的分子印迹固相萃取/液质联用方法。对BISPE 的样品净化效果和基质效应进行评估，合成的填料对样品中3，4-BaP 具有特异吸附效果，达到了显著的富集和净化效果。通过对质谱检测条件的优化，得到了较高的检测灵敏度和稳定性。方法学验证结果表明本方法灵敏度高、精密度好、定量准确。将3，4-BaP 的分子印迹固相萃取/液质联用方法应用于烟熏鲟鱼中3，4-BaP 检测发现12 批次阳性样品，除一批次以外均符合国际限量标准。与中性氧化铝等常规填料的固相萃取柱相比，BISPE 柱在3，4-BaP 分子选择性、回收率、稳定性方面更加优秀。该方法适用于烟熏鲟鱼中3，4-BaP 残留检测，相关数据能为职能部门决策提供依据和参考，进而为消费者食品安全提供保障。