有氧运动对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响及机制

袁国强，秦永生，彭朋△

高血压时由于心脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）代谢紊乱、胶原过度沉积而发生心肌纤维化，患者易合并急性心脏损伤（如心律失常、心肌梗死）［1］。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）信号通路以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）/组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）动态平衡分别是调控胶原合成与降解的主要因素，也是维持ECM 稳态的关键调节因子［2］。规律体力活动是高血压防治的重要非药物手段，主要方式为有氧运动（跑步、游泳、蹬车等）［3］。研究证实，有氧运动对高血压患者具有心血管保护效应，不仅能够有效降低血压水平，还可抑制心肌细胞凋亡、改善心肌纤维化、增强心功能并提高生活质量［3］。本课题组前期研究显示，自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）经过8 周跑台运动后心肌胶原沉积减少，心脏重构得到抑制［4］，然而24 周大负荷运动则加重心肌梗死大鼠心肌纤维化并促进心脏重构［5］，提示体力活动的健康效应具有运动负荷依赖性。因此，本研究以SHR 为模型，以中等强度有氧运动为干预措施，观察长期（24周）体力活动对心肌纤维化的影响，并探讨胶原代谢调控因子TGF-β1、CTGF、MMP-2 和TIMP-2 在其间的作用机制，为高血压患者临床康复处方的制定与优化提供依据和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 30只12周龄SPF级雄性SHR，体质量（220±18）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2018-0027。采用随机数字表法将其分为安静对照（SHR-rest control，SHR-RC）组和有氧运动（SHR-aerobic training，SHR-AT）组，每组15只。同时以15只同龄、同性别SPF 级Wistar-Kyoto 大鼠作为正常血压（normotensive control，NC）组，体质量（215±22）g。大鼠适应环境1周后开始正式实验，即NC 和SHR-RC 组动物在鼠笼安静饲养，SHRAT组进行24周跑台训练。实验实施过程中，由于意外死亡、训练时拒跑等原因，共剔除6 只大鼠，其中SHR-RC 组2 只、SHR-AT组4只。

1.1.2 主要试剂与仪器 小动物跑台购自正华生物仪器设备公司；智能无创血压测量仪（BP-2010E）购自日本Softron Biotechnology 公司；小动物超声仪（Vevo 3100）购自加拿大VisualSonics 公司；病理切片机（RM2255）购自德国徕卡仪器有限公司；倒置相差显微镜（IX71）购自日本Olympus公司；实时荧光定量PCR 仪（7500 型）购自美国ABI 公司；兔抗鼠MMP-2、TIMP-2、TGF-β1、β-肌动蛋白（β-actin）一抗购自美国Santa cruz 公司；兔抗鼠CTGF、α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 训练方案 首先测定所有大鼠的运动能力［4］：起始跑速5 m/min，坡度0°，每2 min 速度增加1.5 m/min，直到力竭，记录峰值跑速和力竭时间。随后SHR-AT组进行5次/周、共24周的跑台训练，运动强度为60%峰值跑速，运动时间逐渐递增，第1 周为10 min/次，以后每周增加10 min，直至60 min/次。分别于第4、8、12、16、20周重新测定峰值跑速以及时调整运动强度。

1.3 动脉血压测定 末次训练后48 h，采用智能无创血压测量仪测定尾动脉收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP），计算平均动脉压（mean arterial pressure，MAP），即MAP＝（SBP+2×DBP）/3。

1.4 心脏结构与功能检测 血压测定后称量体质量，用小动物超声仪检测心脏结构与功能，取左心室乳头肌水平进行二维短轴扫描（M 超），指标包括：左心室收缩末期直径（left ventricular end- systolic diameter，LVESD）、左心室舒张末期直径（left ventricular end-diastolic diameter LVEDD）、左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 心脏胶原容积分数（collagen volumetric fraction，CVF）测定 大鼠断头处理后取心脏并分离左心室，于左心室最大横径处横切将其分为两部分，一部分用甲醛固定、石蜡包埋、Masson 染色后于倒置相差显微镜下选取10 个视野，并用图像分析软件（Image Pro Plus 6.0，美国）测量胶原纤维面积与所选视野面积的比值作为心脏胶原容积分数（collagen volumetric fraction，CVF）；另一部分左心室组织置于-80 ℃低温冰箱冻存待测相关基因表达。

1.6 胚胎基因mRNA 表达检测 利用实时荧光定量PCR 法测定心脏胚胎基因mRNA 表达量，包括心钠素（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠素（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）。取30 mg 心肌提取总RNA 并转录为cDNA，使用实时荧光定量 PCR 仪测定 mRNA 表达量。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40个循环，记录循环阈值（cycle threshold，Ct）。引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法分析目的基因与内参基因β-actin的比值作为该基因的相对表达量。

Tab.1 The sequence of primer表1 引物序列

1.7 胶原代谢调控分子蛋白表达量检测 利用Western blot法测定胶原代谢调控分子各蛋白表达量。取50 mg心肌组织匀浆并提取总蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取100µg 蛋白样品经7.5%SDS-PAGE 分离后转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。滴加总MMP-2（72 ku，1∶2 000），活化型MMP-2（64 ku，1∶2 000）、TIMP-2（1∶5 000）、TGF-β（11∶2 000）、CTGF（1∶5 000）、α-SMA（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000）、GAPDH（1∶10 000）一抗4 ℃过夜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶2 000）二抗37 ℃孵育1.5 h。充分洗涤后，ECL 发光成像，利用凝胶成像系统（ChemiDoc XRS，美国）拍摄并扫描各条带灰度值。将目的蛋白与内参蛋白（β-actin或GAPDH）灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件包对数据进行处理与分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动脉血压比较 与NC 组比较，SHR-RC组、SHR-AT 组SBP、DBP 和MAP 增加（P＜0.05）；与SHR-RC 组比较，SHR-AT 组 SBP、DBP 和 MAP 降低（P＜0.05）。见表2。

Tab.2 Comparison of arterial pressure betweenthree groups of rats表2 3组大鼠动脉血压的比较 （）

Tab.2 Comparison of arterial pressure betweenthree groups of rats表2 3组大鼠动脉血压的比较 （）

＊P＜0.05；a与NC 组比较，b与SHR-RC 组比较，P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

组别NC组SHR-RC组SHR-AT组F n 15 13 11 SBP（mmHg）125.4±5.6 203.8±9.1a 170.0±6.3ab 423.940＊DBP（mmHg）95.2±4.4 156.2±6.2a 120.0±4.9ab 485.079＊MAP（mmHg）105.3±2.9 172.1±4.9a 136.7±4.3ab 946.078＊

2.2 各组心脏结构与功能比较 与NC 组比较，SHR-RC 组 LVEDD 和 LVESD 增加，LVWT 和 LVEF降低（P＜0.05）；与 SHR-RC 组比较，SHR-AT 组LVEDD、LVESD 降低，LVWT 和 LVEF 升高（P＜0.05）。见表3。

Tab.3 Comparison of cardiac structure and function between three groups of rats表3 3组心脏结构与功能的比较 （）

Tab.3 Comparison of cardiac structure and function between three groups of rats表3 3组心脏结构与功能的比较 （）

＊P＜0.05；a与NC组比较，b与SHR-RC组比较，P＜0.05

组别NC组SHR-RC组SHR-AT组F n 15 13 11 LVEDD（mm）7.45±1.26 9.09±1.43a 7.97±1.32b 5.362＊LVESD（mm）3.63±0.77 5.33±0.88a 4.30±0.71ab 15.937＊LVWT（mm）1.88±0.25 1.56±0.58a 2.05±0.37b 4.338＊LVEF 0.741±0.091 0.439±0.065a 0.671±0.089ab 49.268＊

2.3 各组心肌Masson 染色与心脏CVF 比较 心肌Masson染色观察发现，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。NC 组心肌肌束间有极少量胶原纤维，SHRRC 组心肌间质可见明显胶原沉积及纤维化改变，SHR-AT组纤维化程度较SHR-RC组明显减轻。见图 1。与 NC 组比较，SHR-RC 和 SHR-AT 组 CVF 增加（P＜0.05）；与SHR-RC 组比较，SHR-AT 组CVF下降（P＜0.05）。见图2。

Fig.1 Results of myocardial Masson dyeing in the three groups(×400)图1 3组心肌Masson染色结果（×400）

Fig.2 Comparison of cardiac CVF between three groups of rats图2 3组心脏CVF的比较

2.4 各组心脏胚胎基因mRNA 表达量比较 与NC组比较，SHR-RC 组 ANP、BNP 和 β-MHC mRNA 表达量上调；与 SHR-RC 组比较，SHR-AT 组 ANP、BNP 和 β-MHC mRNA 表达量下调（P＜0.05）。见图3。

Fig.3 Comparison of myocardial fetal gene mRNA expressions between three groups of rats图3 3组心肌胚胎基因mRNA表达量比较

2.5 各组心脏胶原代谢调控分子蛋白表达量比较 与 NC 组比较，SHR-RC 组 TGF-β1、CTGF、TIMP-2 和α-SMA 蛋白表达量上调，活化型MMP-2蛋白表达量及活化型MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05）；与SHR-RC 组比较，SHR-AT 组 α-SMA 蛋白表达量下调，活化型MMP-2 蛋白表达量及活化型MMP-2/TIMP-2 比值升高（P＜0.05），而 TGF-β1、CTGF和TIMP-2蛋白表达量无明显变化（P＞0.05）。各组总MMP-2 蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

3 讨论

高血压代偿期心脏常发生向心性肥厚（心肌增厚、心腔缩窄）以适应过高的外周阻力［7］，然而本研究超声检测则显示SHR 出现左室扩张、心壁变薄、心功能显著下降，提示心脏处于失代偿期并逐渐走向心力衰竭，胚胎基因表达量上调也印证了这一点。组织病理学观察发现，SHR 心脏CVF 明显升高，提示心肌发生纤维化；经过24周干预后，SHR-AT组心脏CVF 较SHR-RC 组明显降低，提示中等强度有氧运动能够延缓高血压心肌胶原沉积，这与本课题组前期研究结果［4］以及其他心血管疾病模型［8］的研究结果一致。心肌胶原沉积减少有利于降低心脏硬度、提高室壁顺应性、恢复心动周期过程中异常的心肌收缩力分布以及改善心肌电不均一性［9］，从而降低高血压心血管不良事件的发生率。更为重要的是，SHR 运动后心腔扩张减轻，心功能增强，胚胎基因表达下调，提示运动在减轻心肌纤维化的同时，还可抑制心脏重塑并延缓心力衰竭进程。然而以往研究表明，长期高强度运动可使运动员［10］、健康动物［11］以及心肌梗死大鼠［5］发生心肌纤维化，提示体力活动的心脏健康效应存在“运动负荷阈值”，超出这一阈值则发生适应不良。由此进一步证实，中等强度有氧运动是高血压患者运动康复的最佳方式。

Tab.4 Comparison of relative protein expressions between three groups of rats表4 3组心脏胶原代谢调控分子蛋白相对表达量（NC组的倍数）的比较 （）

Tab.4 Comparison of relative protein expressions between three groups of rats表4 3组心脏胶原代谢调控分子蛋白相对表达量（NC组的倍数）的比较 （）

＊P＜0.05；a与NC组比较，b与SHR-RC组比较，P＜0.05

组别NC组SHR-RC组SHR-AT组F n 15 13 11总MMP-2 1.01±0.15 0.94±0.12 1.05±0.22 1.218 TIMP-2 1.00±0.18 1.56±0.47a 1.40±0.54a 6.845＊活化型MMP-2/TIMP-2比值1.04±0.33 0.39±0.15a 0.71±0.24ab 21.939＊

心肌纤维化是胶原代谢紊乱所致，其中TGF-β1/CTGF 和MMP-2/TIMP-2 分别是调控胶原合成与降解的主要因子［12］。本研究结果显示，SHR-RC 组TGF-β1、CTGF 和 TIMP-2 蛋白表达量均较 NC 组显著性上调，而活化型MMP-2 以及活化型MMP-2/TIMP-2 比值下降，提示胶原合成增加、降解减少是导致高血压心肌纤维化的主要原因。总MMP-2 无显著性变化，这是由于MMP-2合成初始是以无活性的酶原形式存在（72 ku MMP-2），随后通过翻译后调控而活化（64 ku MMP-2）［13］，提示高血压对MMP-2 酶原并无影响。经过24 周运动，与SHR-RC 组比较，SHR-AT组TIMP-2蛋白表达量虽然无显著性变化，但活化型MMP-2 显著上调，故活化型MMP-2/TIMP-2比值增加，说明TIMP-2对MMP-2的抑制作用解除，MMP-2/TIMP-2稳态失衡得以改善，胶原降解增加，这与Kwak等［14］以衰老大鼠为模型的研究结果一致，提示运动通过增加胶原降解而抑制心肌纤维化。然而SHR-AT组TGF-β1和CTGF蛋白表达量与SHR-RC 组无明显差异，提示规律运动并未对胶原合成产生抑制作用。有研究表明，血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）类降压药可同时通过减少胶原合成以及促进其降解而减轻高血压心肌胶原过度沉积［15］。因此笔者推测，高血压患者在运动康复的同时坚持服用药物对抑制心肌纤维化可能具有协同效应。

此外，本研究还发现，SHR-RC 组 α-SMA 蛋白表达量较NC 组显著增加，α-SMA 是成肌纤维细胞标志物，提示高血压心肌胶原沉积增加的同时还存在成纤维细胞向成肌纤维细胞分化，后者胶原蛋白合成、分泌功能以及促纤维化作用显著提高［16］。24周运动后，与 SHR-RC 组比较，SHR-AT 组 α-SMA蛋白表达量下调，提示有氧运动在改善心肌纤维化的同时还能够抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化。研究证实，TGF-β1和CTGF 可激活成肌纤维细胞［17］，然而SHR-AT 组TGF-β1和 CTGF 蛋白表达量与SHR-RC 组并无明显差异，提示尚存在其他机制参与有氧运动对成肌纤维细胞分化的抑制效应。

综上所述，长期规律有氧运动能够改善SHR 心肌纤维化，并延缓心脏重塑和心力衰竭进程，其机制可能与胶原降解增加（但对胶原合成无影响）以及抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化有关。