HPLC同时测定新泰不同区域丹参药材中8种成分的含量

李志东

新泰市人民医院，山东 泰安 271200

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物，药用部位是干燥根及根茎[1]。传统中医理论和现代研究证实，丹参具有活血祛瘀、调经止血、消肿止痛、扩张冠状动脉及改善心肌缺血等作用。丹参主要含有脂溶性的丹参酮类和水溶性酚酸类化学成分，2015年版《中华人民共和国药典》将丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮I的总量及丹酚酸B作为丹参的质量评价指标。此外，脂溶性的二氢丹参酮Ⅰ，以及水溶性的丹参素、丹酚酸A、原儿茶醛和迷迭香酸等均为丹参的药效成分，发挥抗炎、抗肿瘤、抑制肝损伤和肺纤维化、调节组织修复和再生等功能[2-7]。为了更好地评价丹参的质量，本实验选取其活性成分丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，建立起同时测定这8种成分含量的HPLC条件，并对新泰市不同区域的丹参药材进行了含量测定及分析，旨在为全面控制和综合评价丹参药材质量提供科学的参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate3000超高效液相色谱仪(赛默飞)；GR-202日本AND分析天平(精密度：0.1 mg)； KQ5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；手动移液器(Eppendorf公司，200 μL、1000 μL)；50 g装中药粉碎机(瑞安市百信制药机械有限公司)；UPR-II-10T超纯水机(四川优普超纯科技公司)。

1.2 试药

对照品丹参素(批号：wkq18061906)、原儿茶醛(批号：wkq18081005)、迷迭香酸(批号：wkq18042802)、丹酚酸B(批号：wkq18042503)、二氢丹参酮Ⅰ(批号：wkq18070205)、隐丹参酮(批号：wkq18021408)、丹参酮Ⅰ(批号：wkq18050206)、丹参酮ⅡA(批号：18012309)均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%。甲醇为色谱纯，水为超纯水。

25组丹参药材于2018年11月分别采集于山东省新泰市禹村(样品1～5)、石莱(样品6～10)、龙廷(样品11～15)、放城(样品16～20)和汶南(样品21～25)5个乡镇，样品经临沂大学王文房教授鉴定为丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

UltiMate3000超高效液相色谱仪，Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%甲酸水作为流动相进行梯度洗脱，梯度程序见表1；流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温为30℃。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备[8-11]

2.2.1对照品 分别取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ及丹参酮ⅡA的对照品适量，精密称定，加甲醇(丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B加80%甲醇水)配制成质量浓度分别为520、780、420、1980、520、360、300、540 μg/mL的各对照品储备液。再精密吸取各对照品储备液适量，置10 mL棕色量瓶中，得到每1 mL中含丹参素26 μg、原儿茶醛39 μg、迷迭香酸21 μg、丹酚酸B 90 μg、二氢丹参酮Ⅰ 26 μg、隐丹参酮18 μg、丹参酮Ⅰ 15 μg、丹参酮ⅡA 27 μg的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 丹参样品用中药粉碎机打粉，过3号筛，各取0.2 g，精密称定，加70%甲醇水20 mL，浸泡24 h，40℃超声30 min，放冷，取续滤液即得。

2.3 方法学考察

在上述的色谱条件下，分别检测对照品、供试品和阴性对照品溶液(甲醇溶液)，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。

图1 对照品(A)与供试品(B)色谱图

2.3.1线性关系考察 分别精密吸取各对照品储备液，稀释为各浓度梯度，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别以丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的质量浓度(μg/mL)和相应的峰面积进行线性回归，计算回归方程，见表2。

表2 8种成分线性关系表

2.3.2精密度试验 取一组供试品溶液(样品14)，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算峰面积。结果显示，供试品色谱峰峰面积的RSD小于3.0%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3稳定性试验 取一组丹参样品(样品14)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于 0、4、8、12、18、24 h进样，计算各色谱峰峰面积。结果显示，各色谱峰峰面积的RSD小于3.0%，表明供试品溶液 24 h内稳定性良好。

2.3.4重复性试验 取一组丹参样品(样品14)6份，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下方法测定。结果显示丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的平均含量分别为0.168 1、0.034 9、1.757 7、56.446 4、0.278 4、1.816 2、0.766 3和3.096 8 mg/g，各色谱峰峰面积的RSD小于3.0%，表明此方法的重复性良好。

2.3.5回收率试验 精密称取一组丹参样品(样品14)0.1 g，共6份，分别加入丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别计算回收率。结果如表3，8种成分的回收率及RSD均符合要求。

表3 加样回收试验结果(n=6)

3 结果与分析

3.1 样品含量测定

取25组丹参样品，按“2.2.2”项下方法制备，精密吸取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算各成分含量，结果见表4。

表4 含量测定结果(n=3)

3.2 样品含量分析

2015年版中国药典规定丹参药材中含丹酚酸B不得少于3.0%，含丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮I的总量不得少于0.25%[1]。本实验采用的提取及检测方法与药典不同，但调查结果显示新泰市5乡镇丹参药材平均值都达到药典要求。采用SPSS 19.0软件统计对新泰市25组产地的丹参以丹酚酸B、总丹参酮(隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮ⅡA的成分含量之和)及总成分(8种检测成分)的量为变量进行聚类分析，结果见图2。

利用系统聚类法，可将药材分为3组，第一组包括1、3、7、22、23、24和25，丹酚酸B的量为32.75～39.26 mg/g，总丹参酮含量范围为2.174 3～5.529 4 mg/g，总成分范围为38.53～46.73 mg/g。主要包括石莱镇左家沟村、禹村镇朱家庄和垤路村、汶南镇东官庄、东鲁庄、西官庄和鲁家沟；第二组包括4、5、6、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20和21，丹酚酸B的量为40.70～53.16 mg/g，总丹参酮含量范围为2.660 0～10.276 0 mg/g，总成分范围为52.50～61.20 mg/g。主要包括放城镇5个村、禹村镇南泉头村和北峪村、汶南镇国家庄、石莱镇苏家庄、徐家岭村、张家峪村和北清泥沟村、龙廷镇龙廷村、杨庄子村、下豹峪村和上豹峪村；第三组包括2和14，丹酚酸B的量为56.45～57.84 mg/g，总丹参酮含量范围为5.679 3～6.798 8 mg/g，总成分范围为64.36～67.54 mg/g，主要包括禹村镇南峪村和龙廷镇大河东村。

4 讨 论

4.1 浸提及色谱条件

结合相关文献，本实验对供试品的制备方法进行了筛选，分别为(1)不同提取方式(回流和先冷浸后超声)：结果显示两种方法提取效率差距不明显，为方便起见采取常温下冷浸24 h再超声30 min；(2)不同提取溶剂(50%、70%、90%甲醇)：结合丹参中8种待测成分的理化性质，综合比较70%甲醇提取比较均衡。

图2 25组样本系统聚类树状图

本实验对供试品的色谱条件进行优化，结果为(1)通过全波长扫描，根据所测成分的色谱行为，280 nm处有较理想吸收；(2)选用Inertsil ODS-3 C18色谱柱，考察不同溶剂流动相，包括甲醇(乙腈)-水、甲醇(乙腈)-0.1%甲酸水溶液以及甲醇(乙腈)-0.5%甲酸水溶液，结果乙腈-0. 1%甲酸水溶液和甲醇-0. 1%甲酸水溶液对8种成分均有较好的分离，由于乙腈的毒性和成本选择甲醇-0. 1%甲酸水溶液梯度洗脱；(3)考察不同柱温(30、35、40℃)下的图谱，结果表明30℃下分离度最好。

本实验建立的同时测定丹参药材中8种成分的分析方法，简便易行，结果稳定可靠，为丹参药材及其制剂的质量控制提供了依据。

4.2 新泰市丹参种植分析

通过检测结果及聚类分析可以看到，新泰市作为丹参药材的地道产区，药材质量达到了高水准，分类的三组含量差距不大，尤其中间组(第二组)包涵了25个样品地的16个，保持了药材质量的稳定；第三组不但丹酚酸B含量高，而且总丹参酮含量均值也是最高的，主要集中在龙廷和禹村的一小部分，可以进一步分析其高质量的原因，总结优势；第一组相比较其他两组含量略少，主要分布在汶南的大部分及禹村、石莱的一部分，究其原因可能是常年连作没有注意休整土地。本实验只做了新泰市内各区域的丹参质量对比，后续实验还会与全国其他主要产区的丹参做比较分析。

山东泰沂山脉是我国传统的道地丹参药材产区，新泰市位于泰沂山脉腹地。当前新泰市年产量达1.5万吨，丹参栽培面积约5万亩，主要集中在龙廷、汶南、石莱、放城、禹村和楼德等乡镇，即新泰市的东南和西南部。此地为丘陵地带，土壤以棕壤土、砂性壤质土为主，特殊的地理地貌、土壤类型和适宜的气候条件为丹参提供了优良的生长环境，也造就了当地悠久的丹参种植历史。近年来，新泰市立足丹参道地药材产区优势，围绕区域特色化、生产标准化，推动以丹参为主的中草药产业精品化发展，建成全省重要的中草药种植基地。本实验对不同区域丹参质量进行检测，旨在为进一步分析其质量优劣的成因、加强各种植区域经验交流、技术合作和资源整合，进而为规范化规模化种植丹参、做大做强丹参产业打下基础。