阿霉素诱导人食管鳞癌细胞凋亡的实验研究

刘玟琳 冯 彤 苑亚娇 徐建玲 蒋汉明

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271000

食管癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其死亡率位居世界肿瘤死因的第6位[1-3]。尽管放疗、化疗、手术和综合治疗等多种治疗方法已用于食管癌的治疗，但其5年生存率也仅为20%～30%[4-5]。我国是食管癌年龄标准化死亡率最高的国家，绝大多数食管癌为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。食管癌起病隐匿，发现时多为进展期[6]，食管鳞癌进展主要分为5个阶段，其中异型增生是其发展的关键[7-9]。目前化疗仍是食管癌最普遍的治疗方法，尤其针对于易复发型和中晚期食管癌患者[10-11]。阿霉素作为蒽环类广谱抗肿瘤药物具有疗效好、活性强等特点，其主要通过抑制拓扑异构酶的活性，发挥抗肿瘤作用。在动物实验和临床应用中表现出较显著的抗肿瘤效果[12-14,18-20]。研究表明，阿霉素可诱导肿瘤细胞S期阻滞，而S期是细胞周期中DNA合成和染色体复制的关键时期。作用于S期的阿霉素，可以有效的抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[15,17]。本实验以人食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706作为研究对象，通过体外实验探讨阿霉素对人食管癌细胞增殖和凋亡的影响，为阿霉素抗食管癌的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人食管鳞癌KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706细胞株，分别购自中科院上海细胞库和北纳生物。KYSE450的基础培养基为MEM，其它细胞基础培养基为RPMI1640，所有基础培养基中均添加10%的胎牛血清和100 U/mL的青链霉素。细胞培养于37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中。

1.1.2药品与试剂 阿霉素购自于Sigma公司，溶于DMSO中，制成5 mg/mL的储备液；cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax抗体购自CST公司；内参GAPDH抗体购自Santa Cruz公司；二抗购自KPL公司；增强型CCK-8、DAPI染色液购自碧云天；Annexin V-FITC /PI双染细胞凋亡检测试剂盒、MitoScreen(JC-1)购自BD公司；BCA微量蛋白定量试剂盒购自索莱宝公司。

1.1.3仪器 全波长多功能微孔板酶标仪(PE Enspire)；流式细胞仪(BD Canto II)；离心机(Minispin)；蛋白质印迹系统(Bio-rad)；血细胞计数板(上海XB-K25)；尼康普通倒置显微镜(TS100)；尼康荧光倒置显微镜(Ti-S)；超净工作台(上海新苗SW-CJ-2F)；CO2细胞培养箱(Thermo-3111)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人食管癌细胞KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706，采用含10%胎牛血清的MEM或RPMI1640培养基，培养皿置于37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中培养，细胞生长至培养皿中80%～90%时进行传代，待细胞生长到对数期进行后续实验。

1.2.2ADM敏感细胞株筛选 取对数生长期食管癌细胞KYSE180、KYSE450、KYSE510、EC9706 3×104细胞/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，过夜。阿霉素浓度设置为5 000，2 000，1 000，500，250，125，62.5和31.25 ng/mL，并设置0 ng/mL为对照组，每个浓度4个复孔。48 h后，吸尽培养基，加入含CCK-8(5 mg/mL)的新鲜培养基，每孔100 μL，37 ℃避光孵育1.5 h，波长450 nm处测定各组的吸光度，计算IC50，实验重复3次，取平均值。IC50最低的细胞为最敏感细胞株。细胞增殖抑制率=(对照组吸光度-处理组吸光度)/对照组吸光度×100%。

1.2.3细胞总蛋白的提取 取对数期的KYSE450和KYSE180细胞，接种于6孔板中，24 h后加入不同浓度的ADM，分别作用48 h和72 h，吸尽培养基，以4 ℃预冷的PBS清洗2遍，加入SDS-裂解液，提取总蛋白。

1.2.4蛋白印迹 将收集的蛋白经定量后，等量蛋白(40 μg)经SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上，5%脱脂奶粉常温封闭1 h。分别用cleaved PARP(稀释比1∶1 000)，cleaved caspase-3(稀释比1∶1000)，Bax(稀释比1∶500)和GAPDH(稀释比1∶3000)抗体4 ℃孵育过夜，然后TBST洗膜3次，5 min/次，TBS洗膜1次，5 min/次，加入HRP偶联的二抗，室温封闭1 h，再次重复上述洗膜步骤，最后显影、定影曝光后分析结果。

1.2.5细胞形态学变化 取对数生长期的KYSE450细胞接种至6孔板中，过夜。加入不同浓度的ADM，48 h后观察，并拍照记录。

1.2.6DAPI染色 ADM处理48 h后的KYSE450细胞，经预冷的PBS清洗2次后加入-20℃预冷的甲醇/丙酮固定液(体积比1∶1)，PBS清洗2次，加入DAPI染色液，避光孵育10 min，再次用PBS清洗，置于荧光显微镜下观察细胞核形态，拍照记录。

1.2.7细胞周期检测 取对数期生长的KYSE180和KYSE450细胞接种于小皿中，ADM处理24 h后，收集细胞，并用1 mL PBS清洗2遍。加入预冷的75%乙醇悬浮，置于摇床上，4 ℃固定过夜，离心后PBS洗涤2遍。加入终浓度为50 mg/L的RNase A溶液，于37 ℃水浴20 min，再加入相同工作浓度的PI试剂，30 min避光孵育，最后上机检测。

1.2.8线粒体膜电位JC-1检测 收集不同浓度ADM处理24 h后的KYSE450细胞，根据BDTMMitoscreen说明，37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中孵育10～15 min，上机检测。

1.2.9细胞凋亡检测 收集不同浓度ADM处理48 h的KYSE450细胞， 4℃预冷的PBS清洗2遍，根据Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明，避光孵育15 min，然后上机检测。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 ADM抑制食管鳞癌细胞增殖

为了验证ADM对食管鳞癌细胞增殖的影响，我们采用不同浓度的ADM作用48 h。结果表明，ADM对各食管鳞癌细胞株增殖具有显著的抑制作用，并呈剂量依赖性。当ADM浓度达到250 ng/L时，除EC9706外，细胞增殖抑制率均超过50%。ADM对KYSE450、KYSE180、KYSE510、EC9706的半数抑制浓度(IC50)分别97.46、111.21、168.63和368.53 ng/mL。其中KYSE450最敏感(表1，图1A)。镜下观察发现，对照组的KYSE450细胞生长饱满，贴壁均匀，细胞边缘完整清晰。随着ADM浓度的增加，皱缩的细胞增多，高浓度组多数细胞变圆，部分细胞未贴壁悬浮于培养基中(图1B)。以上结果表明ADM呈剂量依赖性的抑制食管鳞癌细胞增殖，并诱导细胞死亡。

表1 ADM抑制人食管鳞癌细胞增殖

A:ADM抑制人食管鳞状细胞癌细胞增殖对KYSE450细胞形态变化的影响(× 400)。

2.2 ADM对KYSE450细胞和KYSE180细胞周期的影响

不同浓度ADM处理24 h后的KYSE180和KYSE450细胞S期和G2期细胞比例增加，G1期减少。KYSE180细胞中，对照组S期和G2期的细胞比例分别为20.11%和4.49%，当ADM浓度为187.5 ng/mL时，S期和G2期细胞比例上升至29.9%和64.9%。此后，随着ADM浓度增加，G2期细胞比例下降，S期细胞比例上升。当ADM浓度为3 000 ng/mL时，G2期细胞比例下降至为4.81%，与对照组相比差异无统计学意义。S期细胞比例为44.12%，显著高于对照组；而在KYSE450细胞中，ADM浓度187.5 ng/mL时，S期细胞比例上升至68.36%，随着ADM浓度增加，S期细胞比例虽有所下降但仍显著高于对照组(图2A,B)。以上结果表明，ADM可诱导食管癌KYSE180和KYSE450细胞S期阻滞，在一定浓度范围内，也伴随G2期阻滞。

A & B:阿霉素影响KYSE450、KYSE180细胞周期分布<0.01 vs 对照组)。

2.3 ADM对KYSE450和KYSE180线粒体膜电位的影响

为了验证ADM对KYSE450和KYSE180线粒体膜电位的影响，我们利用JC-1探针检测了不同浓度ADM处理后细胞线粒体膜电位的变化。结果表明，对照组中KYSE450和KYSE180细胞低线粒体膜电位的细胞比率仅为4.77%、1.83%，随着ADM浓度增加，线粒体膜电位下降的细胞比例逐渐增加。当ADM浓度达到3 000 ng/mL时，低线粒体膜电位的细胞比率分别达到了9.83%和8.20%(图3A～D)，但差异无统计学意义。说明ADM并不影响KYSE450和KYSE180细胞的线粒体膜电位。

2.4 ADM诱导KYSE450凋亡

DAPI染色结果表明，对照组细胞核呈现圆形或椭圆形，随着ADM浓度增加，部分细胞核皱缩，着色加深，呈现密度的强荧光团，有些呈新月状聚集(图4A,B)。Annexin V-FITC/PI双染结果表明，ADM可显著诱导KYSE450细胞凋亡，并呈浓度依赖性。对照组细胞凋亡率仅为6.63%,而当ADM浓度达到3 000 ng/mL时，46.6%的细胞发生了凋亡(图4C,D)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.5 ADM对KYSE450、KYSE180细胞凋亡相关蛋白的影响

Western Blot结果显示，随着ADM处理，KYSE450和KYSE180细胞内cleaved caspase-3，cleaved PARP水平显著上升，且呈时间剂量依赖性，而Bax水平在KYSE450和KYSE180细胞中呈现不同的变化趋势。在KYSE450细胞中，ADM处理可诱导Bax水平升高，而在KYSE180细胞中，Bax表现出下降的趋势(图5A～D)。以上结果表明，ADM能激活caspase-3，剪切PARP，促进KYSE450和KYSE180细胞凋亡。

A & B:不同浓度的ADM对KYSE450细胞线粒体膜电位的影响；

A & B:DAPI染色显示ADM诱导的KYSE450细胞凋亡(×400)；

A & B:ADM对KYSE180细胞凋亡相关蛋白表达的影响；C & D:ADM对KYSE450细胞凋亡相关蛋白表达的影响。

3 讨 论

食管癌以淋巴转移为主，进行性吞咽困难为其典型表现，易侵犯气管、喉返神经、颈交感神经等周围组织器官，出现呼吸困难、疼痛呛咳等症状，难以耐受，终末期呈恶病质状态[16]。尽管外科手术和化疗能提高食管癌生存率，但由于广泛转移，复发和耐药的存在，5年生存率仅有20%～30%[4]。

肿瘤细胞的发生发展与细胞生长周期密切关联，S期是DNA合成关键期，从G1期进入S期意味着DNA复制的开始，细胞增殖活动的进行[15,17,20]。阿霉素属于蒽环类广谱抗肿瘤药物，作为一种拓扑异构酶抑制剂，主要通过抑制DNA复制，诱导肿瘤细胞死亡[21]。此外，阿霉素还可通过多种方式发挥抗肿瘤作用，如产生自由基，使DNA链断裂；影响转录过程；影响细胞周期等。虽然阿霉素对各时期的细胞均有抑制作用，但S期的细胞对阿霉素最为敏感。本实验结果表明，ADM可以阻滞KYSE180和KYSE450细胞于S期。与对照组相比，较高浓度下的阿霉素处理KYSE180和KYSE450细胞，S期细胞比率均升高，且KYSE180细胞升高更加明显，说明ADM更易诱导KYSE180细胞S期阻滞。肿瘤的发展不仅受细胞增殖过度的影响，也与细胞凋亡受抑有关[17]。本实验通过DAPI染色和Annexin V-FITC/PI双染均证实ADM可显著诱导KYSE450细胞凋亡，且呈浓度依赖性。在3 000 ng/mL的ADM作用48 h后，46.6%的KYSE450细胞发生了凋亡。在不同类型的肿瘤中细胞凋亡的方式和机制不完全相同。以往研究表明，ADM可以降低肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞的线粒体膜电位，诱导细胞凋亡[22-27]，但本实验结果表明，在食管鳞癌KYSE180和KYSE450细胞中，高浓度ADM虽然可以在一定程度上降低线粒体膜电位，但差异无统计学意义，说明ADM诱导的食管鳞癌细胞凋亡可能并不需要线粒体膜电位的下降。其原因我们推测可能与肿瘤的类型有关。在细胞凋亡过程中，bcl-2家族和caspase家族最受关注[28]。杨建勇等发现，Bax基因能够增加肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，可促进凋亡基因发挥作用[29]。本实验发现，阿霉素可上调Bax的水平，并激活KYSE450细胞内caspase-3，进而对PARP进行剪切，最终导致细胞凋亡。然而在KYSE180细胞中，ADM诱导的细胞凋亡伴随着Bax水平的下降，具体机制还需进一步揭示。

总之，本研究发现，ADM可显著抑制食管鳞癌的细胞增殖，诱导食管鳞癌细胞S期阻滞，并通过激活caspase-3诱导细胞凋亡。本研究为ADM用于食管鳞癌治疗提供了实验基础。本研究仅限于体外培养的食管鳞癌细胞株，体内的药效仍需进一步探究。