利拉鲁肽经AMPK途径对平滑肌细胞KCa3.1蛋白表达的影响

董 鹏，李小红，王俊红，刘超峰2，王玉环，张春虹

血管并发症是糖尿病的主要并发症，高血糖加速动脉粥样硬化发生，动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要原因[1-2]。对糖尿病病人来说选择一种能有效降糖，同时又能对抗动脉粥样硬化药物具有重要的临床意义。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，有研究表明，其具有抗动脉粥样硬化作用[3-4]，且利拉鲁肽能有效减少糖尿病人心血管事件的发生[5-8]；相关报道表明，利拉鲁肽能抑制血管平滑肌增殖，延缓动脉粥样硬化发生[9-10]。课题组前期研究发现，GLP-1类似物利拉鲁肽能有效减少平滑肌细胞KCa3.1蛋白表达。在链尿菌素(STZ)诱导的小鼠模型中，利拉鲁肽抑制平滑肌增殖的作用可能与激活腺苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路有关[10]。目前利拉鲁肽对糖尿病平滑肌KCa3.1与AMPK通路关系研究报道较少。本研究拟根据前期研究，探讨对糖尿病大鼠模型利拉鲁肽是否通过AMPK通路抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及KCa3.1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 血管紧张素Ⅱ(阿拉丁，A107852)，血管紧张素(索莱宝，I8830)，利拉鲁肽Liraglutide(selleck，S8256)，Dorsomorphin (Compound C)(selleck，S7840)，达尔伯克(氏)必需基本培养基(DMEM)，高糖(Hyclone)，血清(CIBCO)，Anti-alpha smooth muscle Actin抗体(abcam，ab124964)，TRITC荧光二抗(Jackson分装)，Hoechst 33342(碧云天，1︰5 000稀释)，Fast Start Essential DNA Green Master(Roche，06924204001)，TRIZOL(Invitrogen，15596026)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，K1622)，RIPA裂解液(强)(西安赫特生物科技有限公司，WB00920)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(bioworld，AP0063)，KCNN4抗体(proteintech，60276-1-lg)，Kv1.3(proteintech，14079-1-AP)，AMPK抗体(abcam，ab32047)，磷酸化AMPK(PAMPK)抗体(abcam，ab133448)，细胞计数试剂盒-8(CCK8)(上海七海复泰生物科技有限公司，C008)，PVDF膜(Millipore)。

1.2 平滑肌细胞制备

1.2.1 大鼠VSMCs的分离与原代培养 SPF级雄性SD大鼠3只，体重约150 g，处死大鼠，在无菌条件下迅速取出全段胸主动脉，将血管转移到含DMEM(10%胎牛血清)的无菌平皿中，使用DMEM培养液清洗中膜层平滑肌数次后，以眼科弯剪剪切成约1 mm 三大组织块；将组织块(约15个小块/段血管)均匀贴放于6 cm培养皿底，间距0.1 cm；组织块旁滴加少量血清，置于37 ℃、5%CO2培养箱中6 h，使组织块干涸并与瓶壁牢固贴附。6 h后加DMEM(20%胎牛血清)培养基，培养箱中静置培养3 d后，细胞从组织块边缘游出后更换培养液，隔天换液1次；当细胞80%融合时，即可传代。

1.2.2 VSMCs的传代培养 使用不含血清的DMEM培养液洗涤细胞2次，加入0.125%胰酶和0.02%EDTAb混合消化液2 mL，室温下消化20 s后转移到37 ℃培养箱中消化1 min，镜下观察发现细胞回缩、间隙增大并有少数细胞脱落时，弃消化液，加入含20%胎牛血清DMEM培养液10 mL终止消化并反复吹打瓶壁细胞成单细胞悬液，按1∶3接种，细胞密度保持1×106个/mL，约3 d长满单层，采用同法继续传代培养。

1.2.3 VSMCs鉴定 采用特异的平滑肌细胞标志物α-actin细胞免疫荧光染色后，胞浆着色为红色，表示细胞为VSMCs，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 平滑肌细胞的培养及干预

1.3.1 细胞增殖 取对数生长期VSMCs细胞，消化计数；按照5 000个细胞每孔铺96孔板(正常培养基)；次日细胞饥饿处理24 h(无血清培养基)；第3天加入药物处理，每组6个重复。细胞培养1 d、3 d、5 d，吸去培养基，每孔加入100 μL无血清培养基，CCK8溶液(避光)10 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中1 h，测定OD450。

1.3.2 细胞造模及检测 将大鼠平滑肌细胞分为4组，进行如下处理：取对数生长期VSMCs细胞，消化计数；按照50×104个细胞每孔铺6孔板(正常培养基)；次日细胞饥饿处理24 h(无血清培养基)；第3天，A组为正常组；B组加入血管紧张素Ⅱ100 nmol/L；C组加入利拉鲁肽1 μmol/L+血管紧张素Ⅱ100 nmol/L； D组加入利拉鲁肽1 μmol/L+AMPK阻滞剂4 μmol/L+血管紧张素Ⅱ100 nmol/L。血管紧张素Ⅱ培养72 h后使用Western-Blotting检测KCa3.1蛋白表达。

1.3.3 Western-Blotting 将培养好的细胞取出，用细胞刮刀将细胞从6孔板刮起，采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬转移至1.5 EP管中，以8 000 r/min离心2 min收集细胞。将离心管中加入RIPA裂解液80 μL，冰上裂解1～2 h，4 ℃条件下，以12 000 r/min离心10 min，上清液即为细胞总蛋白。使用氨基黑定量法测得蛋白样品浓度。配制10%的分离胶，5%的浓缩胶。上样进行电泳，使用PVDF膜进行转膜，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗孵育，4 ℃过夜孵育，清洗；二抗孵育，室温2 h，进行显影。

2 结 果

2.1 平滑肌细胞形态鉴定大鼠血管平滑肌 显微镜下可见细胞呈长梭状、三角状。采用α-actin细胞免疫荧光染色后，胞浆着色为红色，倒置荧光显微镜下观察并拍照，确认为VSMCs。详见图1。

图1 血管平滑肌α-actin细胞免疫荧光染色

2.2 利拉鲁肽对大鼠VSMCs的影响 利拉鲁肽与大鼠血管平滑肌作用15 min后，与基线值比较PAMPK水平明显上升，PAMPK/AMPK比值明显上调，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明利拉鲁肽能促进AMPK磷酸化，激活AMPK细胞通路。详见图2。

＊P<0.05。

2.3 利拉鲁肽对大鼠VSMCs KCa3.1蛋白表达的影响 Western-Blotting实验表明，B组KCa3.1蛋白表达高于A组，差异无统计学意义(P>0.05)。C组KCa3.1蛋白表达较B组下降(P<0.05)。D组与B组KCa3.1蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，D组KCa3.1蛋白表达高于C组，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明血管紧张素Ⅱ对KCa3.1蛋白有一定的促进作用，利拉鲁肽作用于AMPK通路，抑制细胞KCa3.1蛋白表达。详见图3。

＊P<0.05。

3 讨 论

糖尿病后发生动脉粥样硬化是常见并发症，其中平滑肌增殖是动脉粥样硬化发生的重要步骤。有报道表明，GLP-1受体激动剂可对抗增龄和应激导致的动脉粥样硬化斑块增加，通过细胞AMPK/SIRT1/FOXO3a信号通路抑制平滑肌细胞收缩型向分泌型基因的转换[11-17]。既往研究表明，利拉鲁肽能对抗动脉血管粥样硬化，且利拉鲁肽作用于血管内皮及血管平滑肌[12-14]，通过细胞表面GLP-1受体发挥作用，多条细胞通路发挥作用，是否能激活细胞通路，抑制平滑肌增殖，从而影响KCa3.1蛋白表达尚未见报道。

本课题组前期研究表明，GLP-1类似物艾塞那肽具有阻断糖尿病大鼠早期动脉粥样硬化过程KCa3.1的表达，KCa3.1是动脉粥样硬化的重要标志，早期动脉粥样硬化即可出现KCa3.1上升[15-19]。有研究表明，GLP-1类似物利拉鲁肽能激活AMPK通路，抑制细胞增殖，延缓细胞从G0到G1转变[10]。有研究表明，血管紧张素Ⅱ能促进平滑肌细胞增殖[14]，血管紧张素Ⅱ和利拉鲁肽协同作用，利拉鲁肽能抑制血管紧张素Ⅱ导致的平滑肌细胞增殖，利拉鲁肽和AMPK抑制剂共同作用于细胞导致利拉鲁肽抑制平滑肌增殖作用减弱；MTT法测得的增殖曲线证明利拉鲁肽能抑制血管平滑肌增殖，AMPK抑制剂可减弱这种作用[10]。

本研究结果表明，利拉鲁肽作用于大鼠血管平滑肌细胞AMPK通路促进AMPK磷酸化，增加PAMPK/AMPK比值。Western-Blotting表明，利拉鲁肽对糖尿病大鼠动脉平滑肌细胞KCa3.1蛋白表达具有抑制作用。与B组比较，C组KCa3.1蛋白表达明显降低(P<0.05)；与B组比较，D组KCa3.1蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，D组KCa3.1蛋白表达高于C组，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明使用AMPK抑制剂后利拉鲁肽对KCa3.1抑制减弱。本研究结果提示，利拉鲁肽抑制KCa3.1蛋白表达的关键是能有效激活AMPK，激活AMPK通路VSMCs增殖，细胞增殖减缓导致KCa3.1蛋白表达下调。利拉鲁肽作用于其他细胞通路，这些细胞通路是否对VSMCs KCa3.1蛋白表达产生影响，尚需进一步证实。

综上所述，本研究表明利拉鲁肽能激活AMPK细胞通路，从而抑制VSMCs增殖，导致平滑肌细胞KCa3.1蛋白表达下调。