替米沙坦和氯沙坦对胰岛素抵抗大鼠冠状动脉脂联素受体和胰岛素抵抗的影响

心血管疾病是全世界死亡的主要原因。肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)与心血管疾病紧密相关。IR可引起心血管疾病的发展，产生慢性高血糖，进而引发氧化应激，导致炎症反应及细胞损伤，促进动脉粥样硬化斑块形成[1]。脂联素(adiponectin，APN)是由Scherer等在1995年发现的一种脂肪细胞分泌的特异性蛋白，APN通过细胞膜上APN受体发挥生物学效应，目前研究较多的受体主要包括脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2)和T-钙黏素。已有研究提示，IR、肥胖、血脂代谢异常、冠心病及高血压病人血清APN水平降低，血清APN与冠状动脉预后密切相关[2]；血液循环APN水平提高可降低2型糖尿病危险性；血清APN水平与血糖和胰岛素水平呈负相关[3]。

血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blockers，ARBs)替米沙坦，具有降压和改善IR作用，抑制糖尿病病人重构，其机制由于部分激活过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(PPAR-γ)功能，替米沙坦可提高糖尿病病人血清APN水平，高血糖所致APN受体表达下降与内源性血管紧张素Ⅱ水平增高有关，其他血管紧张素受体拮抗剂可增加APN受体的表达。现有循证证据表明，足量替米沙坦在改善高血压病人胰岛素敏感性和IR方面优于其他血管紧张素受体拮抗剂，并增加糖尿病病人APN水平，降低空腹血糖，改善空腹胰岛素水平[4]。本研究探讨替米沙坦和氯沙坦对IR大鼠冠状动脉脂联素受体和IR的影响。

1 材料与方法

1.1 大鼠IR模型制备和分组 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，随机选择6只作为对照组(control group，Con组)，剩余34只予高果糖饲料喂养4周，空腹腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，1周后，测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和空腹血清胰岛素(fasting serum insulin，FSI)，计算胰岛素敏感指数(ISI)，ISI=-In(FBG×FSI)，ISI≤-4.88提示造模成功[5]。实验第5周，将18只IR大鼠分为3组，每组6只大鼠。IR组：生理盐水灌胃4周；替米沙坦组(TEL组)：替米沙坦5 mg/(kg·d)灌胃4周；氯沙坦组(LOS组)：氯沙坦10 mg/(kg·d)灌胃4周。

1.2 体重、血压测量 实验第9周测量4组大鼠体重；应用尾动脉血压仪测量各组大鼠收缩压、舒张压和平均动脉压。

1.3 血清学指标检测 实验结束后，使用酶法测定各组大鼠血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)和FBG。使用双抗体夹心-酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测量血清FSI、APN水平，并计算ISI。

1.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 实验第9周末，分离冠状动脉。冠状动脉组织液氮研磨，提取RNA，立即进行逆转录，逆转录条件95 ℃加热5 min，94 ℃ 20 s，61 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环，72 ℃ 加热5 min，55 ℃ 10 s。测定3组冠状动脉AdipoR1、AdipoR2和APN的mRNA表达。所有引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下，APN引物序列(上游引物：5′-acactccggcacctaacatc-3′，下游引物：5′-gtggccaccactttcttgtt-3′)，扩增片段长度为196 bp；AdipoR1引物序列(上游引物：5′-ctgctggtccttcacagaca-3′，下游引物：5′-catccgccaggttacaaagt-3′)，扩增片段长度为172 bp；AdipoR2引物序列(上游引物：5′-acccacaaccttgcttcatc-3′，下游引物：5′-gctagccatgagcattagcc-3′)，扩增片段长度为233 bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列(上游引物：5′-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAG-3′，下游引物：5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′)，扩增片段长度为75 bp。

1.5 免疫印迹试验(Western Blot) 蛋白质提取，测定各检测指标浓度。SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗孵育，加入用抗体稀释液稀释的APN(1∶1000稀释)/AdipoR1(1∶200稀释)/AdipoR2(1∶200稀释)/GAPDH抗体(1∶800稀释)，进行酶标二抗孵育，每条膜加入适量的发光底物试剂，行化学发光，得到胶片。

2 结 果

2.1 4组大鼠生物学指标比较(见表1)

组别只数体重(g)FBG(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FSI(pmol/L)ISIAPN(μg/mL)Con组6474±41 5.46±0.58 0.522±0.036 1.329±0.081 127.8±16.0 -4.42±0.18 12.80±1.26 IR组 6516±61①9.68±2.65①2.335±0.269①4.008±0.551①178.3±19.5①-5.56±0.26①9.11±0.87①TEL组6486±48①8.51±1.60②1.903±0.212②3.827±0.237①168.2±33.0①-5.25±0.23②12.16±1.21②LOS组6506±42①8.96±1.50①2.283±0.189①3.931±0.289①169.9±28.0①-5.35±0.21①13.16±1.42②

与Con组比较，①P<0.05；与IR组比较，②P<0.05。

2.2 4组大鼠血压比较(见表2)

表2 4组大鼠血压比较 (±s) 单位：mmHg

注：1 mmHg=0.133 kPa。与Con组比较，①P<0.05；与IR组比较，②P<0.05。

2.3 RT-PCR 至实验第9周末，IR组冠状动脉APN mRNA、AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA表达明显低于Con组(P<0.05)，TEL组和LOS组冠状动脉APN mRNA、AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA表达较IR组增高(P<0.05)。详见图1。

与Con组比较，＊P<0.05；与IR组比较，#P<0.05。

2.4 4组大鼠冠状动脉APN、AdipoR1、AdipoR2蛋白表达水平比较 至实验第9周末，与Con组相比，IR组冠状动脉APN、AdipoR1和AdipoR2蛋白表达显著降低(P<0.05)。与IR组比较，TEL组和LOS组大鼠冠状动脉APN、AdipoR1和 AdipoR2蛋白表达明显增高(P<0.05)。详见表3。

组别只数APN/GAPDHAdipoR1/GAPDHAdipoR2/GAPDHCon组60.231±0.063 0.199±0.043 0.159±0.023 IR组 60.021±0.014①0.080±0.031①0.082±0.016①TEL组60.153±0.098②0.159±0.031②0.126±0.033②LOS组60.115±0.073②0.119±0.021②0.124±0.018②

与Con组比较，①P<0.05；与IR组比较，②P<0.05。

3 讨 论

APN和APN受体是IR中的重要生物学物质和结合蛋白。AdipoR1、AdipoR2和T-钙黏素是重要的APN结合受体，在多个脏器和组织细胞中发挥改善IR作用。AdipoR1主要在脑、心、肾、肝、肺、骨骼肌、脾及睾丸中表达并发挥作用，其中骨骼肌含量最丰富；AdipoR2 在肝脏中表达最高；T-钙黏素在内皮细胞和平滑肌中表达最高。本研究结果显示，应用Western Blot方法在各组大鼠冠状动脉均可检测到APN受体AdipoR1和AdipoR2蛋白表达，且于IR时大鼠冠状动脉AdipoR1、AdipoR1蛋白表达发生变化；冠状动脉平滑肌细胞培养后应用Western Blot方法可检测到AdipoR1和AdipoR2蛋白表达，IR或其他因素可调节其表达。有研究表明，AdipoR1表达在多种器官病理情况下下调[6]。相关研究已发现，APN及其受体通过下调磷酸化，改变糖尿病和心力衰竭的病理生理机制[7]。有研究已证实，高糖、高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠表现的心脏功能下降与心肌细胞内AdipoR1表达下降及AMP依赖蛋白激酶(AMPK)磷酸化减少有关[8]。本研究中，IR组血清APN、冠状动脉APN及AdipoR1、AdipoR2表达低于Con组，提示冠状动脉APN及其受体在胰岛素局部IR中具有重要作用。

替米沙坦和氯沙坦均是长效血管紧张素受体拮抗剂，能选择性地抑制血管紧张素Ⅱ的1型受体(AT1)。替米沙坦与其他血管紧张素受体拮抗剂不同的是，替米沙坦与过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)γ的激动剂吡格列酮化学结构上有一定的同源性[9-10]。PPARγ激动作用可改善葡萄糖和脂肪代谢，降低血糖、血脂，增加胰岛素敏感性，降低心血管疾病风险。有研究表明，替米沙坦可上调心肌APN受体2表达，并上调葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)。同时替米沙坦可上调心肌AdipoR1，下调NADPH 氧化酶亚基p22phox、NADPH氧化酶4(Nox4)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和重组人结缔组织生长因子(CTGF)表达，改善糖尿病大鼠心脏功能，通过PPARγ激动调节IR，PPAR-γ激动剂表现为剂量-时间依赖方式增强APN的表达和分泌[4，11]。本研究结果显示，替米沙坦能改善FBG，轻度缓解IR，不具有PPARγ激活功能的氯沙坦作用相对较弱。可见，替米沙坦和氯沙坦在基因和蛋白水平以调控IR大鼠冠状动脉APN和APN受体表达，提示APN受体调控是多方面的，不仅与PPARγ激动相关，还可能与血管紧张素Ⅱ相关。Ushijima等[11]证实替米沙坦和氯沙坦均可增加KK-A(y)糖尿病小鼠APN，并改善IR，两者无显著差异。其他研究已发现血管紧张素Ⅱ灌注导致大鼠心肌肥大，下调AdipoR1表达，减弱AMPK磷酸化作用，提示血管紧张素Ⅱ通过AdipoR1表达下调，减弱APN信号作用，最终降低APN的心血管保护效应[12-13]。氯沙坦作为AT1拮抗剂，抑制血管紧张素Ⅱ的不良作用，减轻交感兴奋，抑制炎症反应，促进血清APN释放，具有保护冠状动脉作用[14-15]。

大鼠冠状动脉内存在APN、AdipoR1和AdipoR2表达，IR时上述受体表达受到抑制。替米沙坦和氯沙坦均能增加IR大鼠血清APN水平，减轻IR引起冠状动脉APN受体表达下降。