丙酯草醚与吡唑草胺防治油菜地杂草羊蹄的复配比例筛选

陈传波，李 双，朱振东，王学贵，殷丽琴，付绍红，李 云，王继胜，杨 进*，邹 琼，陶兰蓉，康泽明，唐 蓉

(1.成都大学，四川 成都 610000；2.成都市农林科学院, 成都 温江 611130；3.四川农业大学，成都 温江 611130)

在我国油菜作为生产上重要的油料作物之一，除了供给60%左右的国产植物食用油外，还在化学工业等方面起着重要作用[1]。虽然目前我国油菜种植面积和总产量均居世界第一，但面对日益增长的消费需求，提高油菜生产的产量和品质是当前急需得到重视的问题[2-4]。大巢菜、婆婆纳、猪殃殃、棒头草、稻槎菜、羊蹄与牛繁缕等我国冬油菜主产区的优势杂草是影响油菜产量和品质的重要因素之一[5]，特别是羊蹄(RumexjaponicusHoutt.)作为一种蓼科酸模属多年生草本植物[6]，其生长常常伴随油菜整个生长期，对油菜的危害很大，不仅与油菜争水、肥、光和生存空间，而且易作为病虫害越冬越夏的场所，严重影响油菜产量和品质[7]。当前利用化学除草剂是控制田间杂草的主要手段之一，但同时存在诸多不可避免的问题(如：长期使用单一化学除草剂会使得杂草对化学除草剂敏感性下降、对阔叶杂草的除草剂缺乏及由于农户用药不当引起的药害、农药残留等[8])，此外，除草剂的类型、施用量、剂型、可防控的杂草种类、气候及土壤条件都严重影响除草剂的有效性[9]。自2003年，德国拜耳公司[10]在合理混用不同类型的除草剂来扩大杀草谱、提高药效、减少用药量、低残留、提高安全性等方面取得一些进展后，除草剂混剂的开发与应用越发受到人们的重视[11]。2种或2种以上除草剂混用，对杂草的作用可能增加或降低药效，混用结果出现3种效应。即加成作用(混用后的药效，表现该混剂的各药剂单用之和)。一般讲化学结构相似、作用机制相同的除草剂混用时，多表现为加成作用、增效作用(混用后对同一种植物的毒力之和增大时，其联合作用应属于增效作用)和拮抗作用(混剂对同一种植物的毒力较各药剂单用的毒力之和显著降低时，其联合作用应属于拮抗作用)。

丙酯草醚是一种新型田除草剂，它是一种2-嘧啶氧基苄基取代苯基胺类衍生物，主要被植物的根、芽、茎、叶吸收可双向传导，药效发挥较快，持效期长，能对禾本科杂草看麦娘、日本看麦娘等和阔叶杂草牛繁缕、繁缕等表现出较好的防治效果，且对目标作物安全无药害，是一种高效安全的油菜田除草剂[12]。前人研究表明，丙酯草醚属于以ALS(乙酰乳酸合成酶)为作用点阻止Val、Ile、Leu的生物合成，进而抑制细胞有丝分裂的抑制剂[13]。另外，吡唑草胺是一种内吸输导性除草剂，具有广泛的生物活性，它是通过阻碍蛋白质合成而抑制细胞生长的乙酰苯胺类除草剂，对作物田的播后苗前和苗后初期的一年生禾本科杂草如野燕麦、马唐、狗尾草等一年生阔叶杂草羊蹄、苋、婆婆纳等效果显著[14]。前人对吡唑草胺原药诱发V79和CHL细胞基因突变和染色体畸变的研究表明，吡唑草胺原药无致基因突变作用，当其浓度超出一定范围时，才有致染色体结构畸变作用，因此，吡唑类化合物以高效、低毒等特点而在农药中扮演着十分重要的角色[15]。

目前，关于丙酯草醚对田间主要杂草的防除效果虽有报道，但关于吡唑草胺对田间主要杂草的防除效果报道较少，特别是两种除草剂混剂组合对油菜田间杂草的的防除效果更是鲜有报道。本研究采用盆栽法评价了不同复配比例的吡唑草胺与丙酯草醚对油菜田间阔叶杂草羊蹄的防治效果，并进一步测定了两种药剂的理想复配比例对羊蹄和油菜常规的生理生化(鲜重、叶绿素含量及ALS活性)的影响，以期能为进一步开发该出两种除草剂的复配制剂来控制油菜田一年或多年生杂草提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试杂草 一年生阔叶杂草羊蹄(RumexjaponicusHoutt)杂草种子，由四川农业大学无公害农药研究实验室收集、保存并提供。

1.1.2 供试油菜 蓉油10(甘蓝型油菜)，由成都市农林科学院作物所油菜育种课题组提供。

1.1.3 供试药剂 95%丙酯草醚原药(山东侨昌现代农业有限公司)；95%吡唑草胺原药(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)。

1.1.4 试验试剂 丙酮、MgC12、95%乙醇、丙酮酸钠、CaCO3、石英砂、NaOH、硫胺焦磷酸、TPP、黄素腺嘌呤二核苷酸FAD、肌酸、K2HPO4、甲萘酚、KH2PO4、H2SO4等(皆为AR试剂)。

酶促反应缓冲液：内含0.1mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.5)、20.0mmol/L丙酮酸钠、1.0mmol/LMgC12、0.5mmol/LTPP和0.01mmol/LFAD。

提取缓冲液：内含0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.5)、1.0mmol/L丙酮酸钠、5.0mmol/L MgC12、0.5mmol/L TPP和0.01mmol/L FAD。

1.1.5 仪器设备 UV-2000紫外分光光度计、CP224S电子天平、DT200电子天平、TGL-16B离心机等。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 药剂复配比例组合设计 根据除草剂筛选原则(Gowing法)[16]，按照丙酯草醚和吡唑草胺在油菜田的施用剂量，各单剂及复配比例分别设置5个梯度，同时设置空白对照，总计16个处理(表1)。

1.2.2 靶标杂草的准备 将采集和室内保存的靶标杂草种子破休眠后浸种催芽，待露白后选择饱满的种子，点播于装有营养土的育苗钵(直径为0.10m×0.10m)内，每盆播30粒，大棚温室内培养至羊蹄1叶1心期间苗，每钵保留4～5株杂草。待杂草5～6叶期时备用。

1.2.3 药剂复配比例的筛选 根据试验设计，将5～6叶期的羊蹄进行喷雾处理，每处理设置3次重复(每个重复5盆)，同时设置空白对照，施药后保持土壤湿润。并与药后10d对各处理靶标杂草鲜重进行称量。

1.2.4 复配比例对羊蹄和油菜的生理生化 采用1.2.2方法进行盆栽羊蹄和油菜，待其4～5叶期，采用丙酯草醚和吡唑草胺，以及增效比例对羊蹄和油菜进行处理，测定药后各处理叶绿素和ALS酶活性的影响。在施药后1、4、7d，分别收集油菜和羊蹄地上部位叶片5g左右，同时设置3次样本重复，叶绿素和ALS酶活性测定样本分别采集，并做好标记保存在封口袋中，存于4℃冰箱中备用。

表1 除草剂复配比例与浓度

1.2.5 叶绿素含量的测定 采用张蜀秋的方法[17]，略有改动。用4mL95%的无水乙醇提取各个处理的叶片0.5g，放置离心机中于10000rpm下离心10min，取出其中的上清液部分；同样加入相同体积的提取液与沉淀中再次离心，将2次所得上清液定容至25mL后用分光光度计测定其在663与646nm处的光吸收值，最终计算出叶绿素含量(mg/g)。

1.2.6 ALS活性的测定 提取ALS：对盆栽试验中的5～6叶期羊蹄与油菜幼苗地上绿叶部分，进行称量并剪碎后用液氮研磨成粉末状。再用适量石英砂加入其中，提取缓冲液按1∶1(g/mL)的比例加入，进行充分的研磨后倒入离心管放置在离心机里进行离心，滤液离心(20000g 20min)，取出上清液作为粗酶液放置4℃以下保存待用。提取过程应在0～4℃的低温冰浴条件下进行[18]。

ALS活性的测定：将1mL酶促反应液和0.5mL粗酶液加入于试管中，先于对照组中加入3moL/L H2SO40.2mL来终止反应而测定组不加，然后在37℃水浴箱中水浴1h后加入3moL/L H2SO4，0.2mL对测定组的反应进行终止。然后将反应产物在60℃脱羧15min，再顺次加入0.5%肌酸(溶于去离子水)0.5mL和5%甲萘酚(溶于2.5moL/L NaOH)0.5mL，放置在60℃反应15min。然后取出进行反复摇匀使其显色，让显色反应液置于室温下降至室温后，将其置于分光光度计在530nm处比色[19]。蛋白含量根据Bradford(1976)采用考马斯亮蓝法测定[20]。酶活力用单位时间内每毫克蛋白催化反应的吸光值表示(0D530/mg protein/h)。

1.3 试验结果处理

1.3.1 药剂复配配比筛选结果处理 除草剂混用药效测定及评价方法，采用Gowing法。

其中：X为A单剂防效(%)；Y为B单剂防效(%)；E0为A、B两单剂相混的理论防效(%)；E为A、B两单剂相混的实际防效(%)；E-E0>10%为增效作用；E-E0<-10%为拮抗作用；E-E0值介于理论值±10%为加成作用。

1.3.2 复配配比生理生化的结果处理 参照张敏等的方法[21]，计算出单剂各浓度处理组对杂草各指标的抑制率及混剂各浓度处理组实际抑制率与理论抑制率的百分比M。

计算公式为：M=混剂处理组实际抑制率/(单剂1抑制率×在混剂中所占比例+单剂2抑制率×在混剂中所占比例)。

其中：M在100左右(一般小于120)为相加作用；明显高于100(大于120)为增效作用；明显小于100(一般为80以下)为拮抗作用。

通过计算得出各处理的叶绿素含量、ALS活性，并运用SPSS Statistics17.0进行Duncan(0.05)方差分析并比较与通过用Sigmaplot 10.0作图来进行分析。

2 结果与分析

2.1 室内复配比例的筛选

2.1.1 各处理对羊蹄鲜重影响 结果表明(表2)，丙酯草醚与吡唑草胺五个不同复配比例的混剂对羊蹄的E-E0值分别为-8.61%，-8.98%，-9.91%，-4.63%，-0.49%，这5个复配比例均处于±10%之间，表现出加成作用。综合考虑生产成本和两种药剂联合作用除草效果等情况，选用60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺的配方来测取药剂对羊蹄和油菜的生理生化影响。

2.2 丙酯草醚与吡唑草胺复配比例对羊蹄和油菜的生理生化

2.2.1 复配比例对羊蹄与油菜叶绿素含量的影响 60μg/mL丙酯草醚、200μg/mL吡唑草胺与60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺复配比例处理羊蹄结果表明(图1A)：在三类药剂处理后1d、4d、7d，羊蹄叶绿素含量均显著低于空白对照处理(P<0.05)，且三类药剂对羊蹄的叶绿素含量在药后1d到4d差异不显著，但在7d时该复配药剂对羊蹄叶绿素含量的抑制明显高于两单剂处理。随着时间的增加，三类药剂处理对羊蹄叶绿素的抑制率逐渐增加(14.0～27.1、15.4～31.7和21.4～40.0)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL复配药剂对羊蹄叶绿素的增效率M在药后1d、4d、7d则分别达到142.4、147.5和152.8，表现出增效作用(图1B)。

表2 药后10d丙酯草醚与吡唑草胺对羊蹄鲜重影响

油菜叶绿素含量结果表明(图1C)：三类药剂处理后1d与空白对照差异均不显著(P>0.05)，而在药后4d和7d，油菜叶绿素含量均显著低于空白对照(P<0.05)，但三类药剂处理之间差异不显著；随着时间的延长，三类药剂处理对油菜叶绿素的抑制率缓慢上升(6.0～19.1、6.8～21.0和9.6～23.6)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL复配药剂对油菜叶绿素的增效率M在药后1d、4d、7d呈下降趋势，分别达到154.5、122.8和120.8，表现出增效作用(图1D)。

2.2.2 复配比例对羊蹄与油菜ALS活性的影响 60μg/mL丙酯草醚、200μg/mL吡唑草胺与60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺复配药剂对羊蹄ALS活性的结果表明(图2A)：在三类药剂处理1d后，ALS的活性均显著低于空白对照(P<0.05)，且三类药剂对羊蹄ALS活性差异不显著；三类药剂处理4d和7d时，60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺复配比例对羊蹄ALS活性明显低于两单剂处理。随着时间的延长，三类药剂处理对羊蹄ALS活性的抑制率逐渐增加(17.2～31.4、20.0～32.6和26.2～44.3)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺复配比例的增效率M在药后1d、4d和7d分别达到146.8、138.9和139.9，表现出增效作用(图2B)。

增效比例对油菜ALS活性的结果(图2C)显示，药后1d，三类药剂处理与空白对照差异均不显著(P>0.05)；药后4d和7d，三类药剂处理油菜ALS活性显著低于空白对照(P<0.05)；在药后1d与7d，丙酯草醚60μg/mL和吡唑草胺200μg/mL与复配药剂对油菜ALS活性差异不显著，但在4d时复配药剂对油菜ALS活性明显低于两单剂；且三类药剂处理对油菜ALS活性的抑制率随实验时间的延长逐渐加强(5.8～14.6、7.1～14.6和11.5～17.7)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺复配药剂对油菜叶绿素的增效率M在药后1d、4d和7d呈下降趋势，分别为189.7、137.8和120.9，表现出增效作用(图2D)。

3 讨论与结论

合理使用除草剂可以有效防除农田杂草的发生，但前提是对作物安全。本文研究结果表明，在单一使用丙酯草醚时，羊蹄鲜重随药剂浓度增加而增加；在单一使用吡唑草胺时，羊蹄鲜重随药剂浓度减小反而增加；而所有复配比例对羊蹄鲜重防效均表现出相加作用，且明显高于单一药剂对羊蹄鲜重防效。考虑到成本、防治效果及安全性等因素，本研究选用吡200+丙60的复配比例配方来测取药剂对羊蹄与油菜的生理生化影响，结果表明筛选得到复配药剂的对羊蹄的叶绿素含量与ALS活性有着较好的抑制作用，而对油菜幼苗的叶绿素含量与ALS活性抑制效果较小，表现出较好的选择性。本试验复配比例在药后7d结果显示，复配比例处理对羊蹄叶绿素含量的抑制率达到了40.0%，而对油菜的仅有23.6%，丙酯草醚对油菜幼苗的叶绿素含量也有一定的抑制作用。郭翔等[22]研究发现，500、1000mg/L浓度丙酯草醚处理下大麦叶片的非光化学淬灭(NPQ)值表现出先升高后下降的现象，说明了植株能上调NPQ来保护光合系统，降低外界影响对光合系统的伤害。本研究亦发现，施药后1d、4d和7d时，复配比例对羊蹄的叶绿素含量抑制率的增效率在随着时间的增加而增加，而对油菜的增效率却是随之减少，分析可能为除草剂施用后，油菜在药剂胁迫压力下，迅速诱导激发作物应对保护机制，随着时间的验证，这种保护作用越发增强，从而降低药剂的影响，这与郭翔等研究相符。

此外，除草剂植物体内吸收、运转的难易能影响药效的发挥，所以除草剂在作物与杂草之间的吸收和传导的差异是选择性作用的原因之一[23]。赵丹丹等[24]研究发现，丙酯草醚对牛繁缕ALS活性有着较大的抑制作用，且会随着时间而增强，在第5d达到了53.6%，而对油菜却没有明显的抑制作用。陈杰等[12]研究发现，丙酯草醚在45g ai/hm2条件下处理反枝苋，处理后测得ALS的活性明显呈规律性下降，在第4d已经下降了50%左右，有明显的抑制作用，但除草活性发挥缓慢。本实验表明，羊蹄与油菜经过丙酯草醚60μg/mL+吡唑草胺200μg/mL处理过后，对羊蹄的ALS活性有着明显的抑制作用，并随着时间的推进而加强，在第7d达到了44.32%，而对油菜的ALS活性的影响却不大，仅有17.71%；对羊蹄ALS的增效率随时间增加先减后升，可能为丙酯草醚吸收输导作用的差异导致前期增效较小，到后面吸收累积后作用效果明显增加。另外，李政等[25]的研究发现，水稻对丙酯草醚的吸收量要大于油菜，且随时间推进有增加的趋势，丙酯草醚吸收量以及单位质量中积累量在水稻与油菜中的差异可能是丙酯草醚对两者产生选择性的机理之一。推测在本研究中油菜和杂草羊蹄对丙酯草醚吸收量以及单位质量亦存在类似的积累量差异，导致丙酯草醚对羊蹄的抑制明显高于油菜，但这种机理目前尚不明，有待进一步研究。

总之，除草剂对靶标杂草产生的效果会受到产品质量、环境、抗性、施用方式等诸多因素影响，本实验仅在盆栽实验对丙酯草醚与吡唑草胺的增效比例及生理生化进行初步的探究，需进一步的实验验证其防治效果和安全性。