丁草胺及其复配剂对水生生物的急性毒性与安全性评价

曾兆华，林 涛，林岭虹，方慧玲，朱珍珍，杨 广，游 泳*

(1.福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013；2.害虫绿色防控福建省高等学校重点实验室，福建福州350002)

丁草胺是一种酰胺类内吸传导型选择性芽前除草剂，其除草机理是通过杂草幼芽和幼小的次生根吸收，抑制蛋白酶的活性，阻碍蛋白质的合成，从而使杂草幼株肿大、畸形、色深绿，最终死亡(黄炳球等，1993)。主要用于稻田防除以种子萌发的禾本科杂草、一年生莎草及某些阔叶杂草，但对阔叶杂草防效较差。因此，为了扩大防治谱，丁草胺常与其他对阔叶杂草效果好的除草剂混用。丁草胺疏水性大，易被土壤胶体粒子吸附，淋溶性小，具有稳定性强、残留期长等特点(姚斌等，2003)。

丁草胺是水稻上使用最广谱的三大除草剂(丁草胺、乙草胺、草甘膦)之一。1969年在美国孟山都公司开发投产，1982年在我国正式登记并大面积推广应用，由于长期单一使用，导致稗草对丁草胺产生了抗药性，使药效明显下降(黄炳球等，1993)。1993年稻田稗草对丁草胺的抗药性在我国首次报道(黄炳球等，1993)。截止2017年，全球已有252种杂草(146种双子叶，106种单子叶)产生了抗药性。其中，我国已报道了43种。全球范围内抗性杂草的数量还将持续不断地增加，而具有新作用机理的除草剂开发越来越难，因此选择不同抗性机制的药效交替或混配使用是提高防效及延缓杂草产生抗药性的有效措施，但复配后的农药通过漂移径流、渗透等途径进入水体，对水环境中生物造成危害差异较大(耿翠敏，2015)。

目前，丁草胺在水稻上的复配制剂主要有丁草胺·乙氧氟草醚，丁草胺·丙炔噁草酮，丁草胺·吡嘧磺隆，丁草胺·敌俾，丁草胺·苄嘧磺隆等(李海怡等，2011)，对其在杂草上的毒力研究居多，对水生生物大多数都关注于单一农药的影响(Wanget al，2017)，而多种农药的联合毒性作用研究甚少。藻类、溞类和鱼类是水生生物生态系统中主要组成部分，是目前水生生态毒理学研究的标准测试生物，被广泛应用于水生生物毒性测试和评价(王翔等，2006)。因此，为进一步掌握丁草胺及其复配剂对水生生物的毒性特点。本研究以斜生栅藻、大型溞、斑马鱼为试验对象，按照《化学农药环境安全评价试验准则》(中国国家环境保护局，1990)和OECD“化学品测试方法”(OECD，1984a，1984b，1992)的要求，测定丁草胺及其复配剂对以上3种生物的急性毒性，为今后评估稻田除草剂对非靶标水生生物的生态风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试生物及来源

斜生栅藻(Desmodesmus subspicatus)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供。斜生栅藻在无菌条件下转移至水生4号培养液中(中华人民共和国农业部，2014c)，培养至对数生长期进一步扩大培养。培养温度21～24℃；光照强度4 440～8 880 lx；连续均匀光照。试验起始藻镜检浓度为5.0×103～5.0×104个·mL-1，试验时，斜生栅藻处于同步生长阶段。

大型溞(Daphnia magna)由中国科学院水生生物所提供，实验室自行保种繁育。试验用溞为同一母体孤雌繁殖3代以上，出生24 h内的非头胎溞。温度(20±1)℃；光照周期L∶D=16 h∶8 h。试验期间使用标准稀释水ISO且水质保持稳定(中华人民共和国农业部，2014b)，硬度为158 mg·L-1(以CaCO3计)。

斑马鱼(Brachydonio rerio)购自福州海洋之星水族馆，试验前在实验室预养7 d以上，试验前24 h停止喂食。试验用鱼体重0.2～0.4 g，体长2.0～3.0 cm，试验用水为经活性炭处理、曝气去氯24 h以上的自来水(中华人民共和国农业部，2014a)。水质硬度为71 mg·L-1(以CaCO3计)，光周期 L ∶D=12 h ∶12 h。

1.2 药剂

50%丁草胺乳油、70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油均由山东玥鸣生物科技有限公司生产。

1.3 斜生栅藻的急性毒性试验

基于前期急性毒性试验结果，分别将供试农药用BG11培养基稀释液溶解成系列梯度浓度。其中 50%丁草胺乳油为 3.240×10-3、4.966×10-3、7.601×10-3、1.164×10-2、1.780×10-2mg a.i.·L-1的处理溶液，分别量取50 mL药液到锥形瓶内，再接种50 mL的藻液，振荡混匀，混合得到含1.620×10-3、2.483×10-3、3.801×10-3、5.820×10-3、8.900×10-3mg a.i.·L-1的处理藻液；70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油为 2.117×10-3、3.789×10-2、6.909×10-3、1.237×10-2、2.229×10-2mg a.i.·L-1的处理溶液，混合得到含1.059×10-3、1.895×10-3、3.455×10-3、6.185×10-3、1.115×10-2mg a.i.·L-1的处理藻液；75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油为1.703×10-4、2.546×10-4、3.818×10-4、5.736×10-4、8.600×10-4mg a.i.·L-1的处理溶液，混合得到含 8.515×10-5、1.273×10-4、1.909×10-4、2.868×10-4、4.300×10-4mg a.i.·L-1的处理藻液；78%丁草胺·噁草酮乳油为 3.391×10-4、8.785×10-4、2.281×10-3、5.934×10-3、1.541×10-2mg a.i.·L-1的处理溶液，混合得到含 1.696×10-4、4.393×10-4、1.141×10-3、2.967×10-3、7.705×10-3mg a.i.·L-1的处理藻液。 试验每组浓度均设 3 次重复，并设空白对照。在温度21～24℃、光照强度4 440～8 880 lx的人工气候箱内开展。在生物显微镜下用血球技术板准确计数0、24、48、72 h的藻细胞数，并观察其中毒症状。计数时，同一样品至少计数2次，如计数结果相差大于15%，应予以重复计数，试验数据采用生物量比较分析和计算抑制率。

式中，Iy表示处理组生物量增长的抑制率(%)；Ye表示空白对照组测定的藻类细胞数(个·mL-1)；Yt表示处理组测定的藻类细胞数(个·mL-1)。

1.4 大型溞的急性毒性试验

基于前期急性毒性试验结果，分别将供试农药用ISO标准稀释水溶解成系列梯度浓度。其中 50%丁草胺乳油为 0.814、1.221、1.831、2.747、4.120 mg a.i.·L-1的溶液；70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油为 1.039、1.454、2.036、2.850、3.990 mg a.i.·L-1的溶液；75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油为 0.509、0.851、1.420、2.371、3.960 mg a.i.·L-1的溶液；78%丁草胺·噁草酮乳油为 0.582、1.019、1.783、3.120、5.460 mg a.i.·L-1的溶液。 分别量取 50 mL 药液到100 mL烧杯内，每个烧杯中加入5只幼溞，并设空白对照，重复4次。在24、48 h观察并记录大型溞的中毒症状和活动受抑制数。试验在温度(20±1)℃、光照周期L∶D=16 h∶8 h的人工气候箱内开展。

1.5 斑马鱼的急性毒性试验

试验采用“半静态法”，基于前期急性毒性试验结果，分别将供试农药用曝气水稀释溶解成系列梯度浓度。 其中50%丁草胺乳油为0.330、0.396、0.475、0.570、0.684 mg a.i.·L-1的溶液；70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油为 0.168、0.286、0.485、0.825、1.403 mg a.i.·L-1的溶液；75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油为 0.608、0.729、0.875、1.050、1.260 mg a.i.·L-1的溶液；78%丁草胺·噁草酮乳油为 0.608、0.729、0.875、1.050、1.260 mg a.i.·L-1的溶液。 每个鱼缸中含5 L的不同浓度处理药液。试验每组浓度均用斑马鱼10只，重复3次，并设空白对照。试验开始后6 h内随时观察并记录斑马鱼的中毒症状及死亡数，其后于24、48、72、96 h观察并记录斑马鱼的中毒症状及死亡数。试验在水温(23±1)℃，光周期L∶D=12 h∶12 h室内开展。

1.6 数据处理

使用SPSS 19.0软件中Probit(概率单位法)进行统计计算LC50、EC50及95%置信限等参数。

2 结果与分析

2.1 4种除草剂对斜生栅藻的急性毒性与安全性评价

50%丁草胺乳油、70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油对斜生栅藻 72 h 的 EC50分别为 4.143×10-3、3.207×10-3、1.936×10-4、1.144×10-3mg a.i.·L-1(表1)，参照蔡道基(1999)建议的农药对藻类的毒性等级划分标准，4种供试农药对斜生栅藻的毒性等级均为高毒(EC50≤0.3 mg a.i.·L-1)。

表1 丁草胺及其3种复配剂对斜生栅藻的急性毒性Table 1 Acute toxicity of the butachlor agent and its 3 joint compounds to Desmodesmus subspicatus

2.2 4种除草剂对大型溞的急性毒性与安全性评价

50%丁草胺乳油、70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油对大型溞 48 h 的 EC50分别为 1.576、2.165、1.284、1.595 mg a.i.·L-1(表2)，参照《化学农药环境安全评价试验准则》(中国国家环境保护局，1990)中农药对溞类的毒性等级划分标准，4种供试农药对大型溞的毒性等级均为中毒(1.0 mg a.i.·L-1＜EC50≤10.0 mg a.i.·L-1)。中毒后的大型溞表现出游动不积极、反应迟钝、沉底的现象。

2.3 4种除草剂对斑马鱼的急性毒性与安全性评价

由“半静态法”试验结果(表3)可知，50%丁草胺乳油、70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油对斑马鱼96 h的LC50分别为0.440、0.407、0.871、0.445 mg a.i.·L-1，参照《化学农药环境安全评价试验准则》(中国国家环境保护局，1990)中农药对鱼类的毒性等级划分标准，4种供试农药对斑马鱼的毒性等级均为高毒(0.1 mg a.i.·L-1＜LC50≤1.0 mg a.i.·L-1)。中毒后的斑马鱼表现出侧游、游动缓慢、身体发黑的现象。

表2 丁草胺及其3种复配剂对大型溞的急性毒性Table 2 Acute toxicity of the butachlor agent and its 3 joint compounds to Daphnia magna

表3 丁草胺及其3种复配剂对斑马鱼的急性毒性Table 3 Acute toxicity of the butachlor agent and its 3 joint compounds to Brachydanio rerio

3 讨论与结论

试验结果表明，4种供试农药对斜生栅藻的急性毒性均为高毒，毒性排序为：50%丁草胺乳油＜70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油＜78%丁草胺·噁草酮乳油＜75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油。丁草胺复配剂对斜生栅藻的毒性明显高于单剂，而复配剂之间的毒性又存在差异，其原因可能与不同除草剂之间存在着协同增效或拮抗作用有关(韦小燕等，2004)。藻类的毒性因农药品种和藻类的不同而不同，主要是对藻类细胞生物膜、光合作用、呼吸作用、和藻类生化成分等4个方面的影响。而且农药对藻类的影响在很大程度上表现为“低激高抑”的浓度相关性(欧晓明，2009；黄健，2017)。

4种供试农药对大型溞的急性毒性均为中毒，其中70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油的EC50＞50%丁草胺乳油，其原因可能是异噁草松和吡嘧磺隆原药对大型溞的48 h的EC50分别为12.7和700 mg a.i.·L-1，皆为低毒(IUPAC)，两者低毒性的除草剂与丁草胺复配后降低了丁草胺的毒性。因此为了降低多元复配剂对水生生物造成严重性危害，可以复配低毒性的除草剂来降低单一成分的毒性(游泳等，2018)。78%丁草胺·噁草酮乳油EC50＞50%丁草胺乳油EC50＞75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油EC50，表明乙氧氟草醚增加了丁草胺·噁草酮复配剂的毒性。乙氧氟草醚是触杀性除草剂，Ibrahimet al(2019)研究表明乙氧氟草醚能够引起蜗牛抗氧化系统的改变，消化腺中的组织病理学变化，包括消化细胞的严重损伤。因此，复配后的乙氧氟草醚是否对大型溞造成一定的生理毒性有待进一步探究。

4种供试农药对斑马鱼的急性毒性均为高毒，其中75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油毒性低于50%丁草胺乳油，可能是因为药剂复配后丁草胺含量低，且药剂生产过程中使用的助剂对斑马鱼的毒性较低；Guo et al(2010)通过丁草胺暴露于比目鱼(牙鲆)鳃、肝、肾的组织病理学研究表明，鳃是丁草胺的靶器官。鱼鳃可直接、大面积接触水中的毒性物质造成损伤，从而干扰正常的呼吸、分泌和排泄功能，引起鱼体代谢紊乱、窒息、甚至死亡。而噁草酮和乙氧氟草醚皆为触杀型除草剂在与内吸型除草剂丁草胺复配后是否存在降解丁草胺作用于靶器官的毒性有待进一步探究。

本试验测定的4种供试农药对斜生栅藻、大型溞、斑马鱼的急性毒性等级分别为高毒、中毒、高毒，这4种供试农药对3种水生生物的急性毒性不同可能与生物种群、农药作用方式和机制不同有关。有研究表明丁草胺对陆生生物的毒性低，其中鹌鹑急性经口LD50＞10 000 mg a.i.·L-1，蜂经口LD50＞100 mg a.i.·L-1(殷立成，2007)，但对鱼类及水生生物毒性大。以鱼为最敏感，鱼种又略高于鱼苗，而对水溞的毒性却偏低(李凤珍等，1989)，这与本研究结果相一致。范立民等(2005)测定了丁草胺对白鲢的96 h的EC50为0.134 mg a.i.·L-1，属高毒农药，同时又分析了黄鳝腹腔注射染毒前后微核率的变化，其结果表明，丁草胺对鱼具有致突变性。有人研究发现22种除草剂能够通过改变藻类的生长和蛋白质合成模式从而改变环境。其中，丁草胺对林克式念株藻的毒性也认为是抑制蛋白质的合成(张雪娇，2008)。丁草胺及其复配剂对大型溞的毒性显著低于斜生栅藻和斑马鱼。可能是因为丁草胺主要通过干扰植物光合作用、植物激素或植物分子合成发挥毒性效应，从而导致其对大型溞的生理系统难以发生反应性毒性效应。而除草剂对大型溞的急性毒性机理主要与化合物疏水性程度和离子化程度有关(闫俐辰等，2018)。

综上所述，50%丁草胺乳油、70%丁草胺·异噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油4种供试农药对大型溞的安全风险性较低，但对斜生栅藻和斑马鱼的安全风险性很高，因此在施用农药时，应注意其对藻类的危害；避免在雨天或鱼类敏感水区及保护区附近施用，防止含有农药的稻田水流入水中；在稻田养鱼的农业模式中，要在农药完全降解或达到安全浓度以后再进行养殖。