重复经颅磁刺激对甲基苯丙胺依赖代谢的影响*

周亚男 杨 栋 罗银利 杨 超

甲基苯丙胺(Methamphetamine，MA)是以苯丙胺为母体衍生而来的化学合成品，具有极强的耐受性和成瘾性[1]，并且具有复吸率高、易获得以及躯体戒断症状不明显等特点[2]。近年来，由于MA成瘾者的人数逐年上升，MA依赖已是目前最严重的社会公共卫生问题之一[3]。重复经颅磁刺激(repetitive Transcranial Magnetic Stimulation，rTMS)作为一种无创的神经调控技术，近年来已逐步应用于物质成瘾领域。研究发现rTMS可降低物质依赖者的渴求、提高戒断率，但rTMS 应用于MA依赖的相关研究甚少[4]。代谢组学(Metabolomics)作为新兴组学技术，已成为系统生物学的重要组成部分，它通过检测体液或组织中存在的各种小分子代谢物，在疾病的早期诊断和治疗检测过程中发挥重要作用[5,6]。故本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-high Resolution Mass Spectrometry,UPLC-MS)技术测定MA依赖患者rTMS前后血浆代谢组学数据，采用多元变量统计分析方法筛选与MA依赖及其rTMS治疗相关的差异性代谢物，分析关键代谢通路，探讨MA依赖形成与代谢变化的关系，为MA依赖诊治及rTMS的应用提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2018年4月～2019年11月期间在湖南省脑科医院就诊的甲基苯丙胺依赖患者30例纳入研究组。入组标准：(1)符合美国精神障碍诊断与统计手册第5版(DSM-V)甲基苯丙胺依赖的诊断标准；(2)年龄 18～60 岁；(3)处于急性脱毒后康复期，无明显躯体戒断症状；(4)无明显躯体、精神疾病；(5)不愿接受常规戒毒治疗。排除标准：(1)不能遵守研究要求者；(2)有DSM-V 其他精神活性物质依赖史者；(3)有重大躯体疾病、重性精神障碍、脑器质性疾病或颅脑外伤者；(4)既往有癫痫发作或有癫痫病家族史者；(5)有心脏起搏器植入或耳蜗植入者。从湖南省脑科医院体检中心招募健康志愿者30名纳入对照组。研究组男20例，女10例，平均年龄(31.53±3.66)岁；对照组男19名，女11名，平均年龄(32.32±4.33)岁。两组性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究获得湖南省脑科医院伦理委员会的批准，研究开始前所有参与者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 Vanquish型超高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)，Q Exactive HFX 型高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)；PS-60AL型超声仪(深圳市雷德邦电子有限公司)；YRDCCY-1 型经颅刺激仪(武汉依瑞德有限公司)。

1.2.2 治疗方法 研究组进行rTMS干预，使用环型线圈(外径 125 mm)，线圈放置与颅骨平行,治疗部位为左背外侧前额叶,刺激频率为 10 Hz，刺激强度为 100% 运动阈值，每序列 50 次脉冲，每天 40 个序列，每串刺激 5 s，间歇 10 s，每次治疗共2 000次脉冲。每周进行5次治疗，干预时间为 4 周。对照组不予任何处理。

1.2.3 行为学观察 采用强迫性毒品使用量表(OCDUS)[7]分别于rTMS干预前、干预后，对研究组的心理渴求现状展开评估。该量表一共13个条目，各个条目均采取李克特5点评分，1～5分分别对应没有～非常多，总分为每个条目评分之和，总分越高渴求程度越高。

1.2.4 样品采集及处理方法[8]分别于rTMS干预前、干预后两次采集研究组静脉血进行代谢组学检测，对照组采集1次即可。具体步骤：采用促凝真空采血管收集受试者空腹肘静脉血10 ml，上下颠倒混匀，快速于4 ℃，3 500 r/min离心15 min。移取100 μl样品至EP管中，加入400 μl提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)，含同位素标记内标混合物]，涡旋混匀30 s后超声10 min(冰水浴)，于-40 ℃静置1 h。将样品4 ℃，12 000 rpm离心15 min，取上清上机检测。另外制备QC样品，由所有样品取等量上清混合。

1.2.5 样品采集及处理方法[9]色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色谱柱，流动相：水(含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水)(A)：乙腈(B)，梯度洗脱程序：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B。流动相流速：0.5 ml/min，柱温：30 ℃，样品盘温度：4 ℃，进样体积：2 μl。流动相使用前超声脱气。

1.2.6 质谱条件 样品质谱数据分别以正负离子扫描模式采集，离子源参数如下：鞘气流速：50 Arb；辅助气体流速：10 Arb；毛细管温度：320 ℃；碰撞能量：10/30/60V；电喷雾电压：3.5 kV(+)或-3.2 kV(-)。

2 结果

2.1 研究组rTMS治疗前后OCDUS评分比较 研究组rTMS治疗后OCDUS总分及毒品的影响、渴求的频率及毒品失控评分均较治疗前降低(P<0.001)。见表1。

表1 研究组rTMS治疗前后OCDUS评分比较

2.2 质量控制 样品检测过程中实时地对质控样品(Quality Control, QC)进行检测，以评价分析系统的稳定性，确保采集数据的质量[6]。经检测，QC样品间差异小(≤±2 STD)，相关性越接近于1，重复性良好，分析系统稳定，结果稳定可靠。见图1。

注：A-正离子模式，B-负离子模式

2.3 多元变量统计分析 对照组(组1)、研究组基线时(组2)、研究组经rTMS干预后(组3)血浆样品经LC-MS分析得到数据，采用PCA对三组血浆的代谢谱图进行分析，得到相应的散点分布图。PCA结果表明，三组样本间呈现一定的分离趋势，结果如图2所示。为避免PCA模型或PLS模型分析中相关变量造成的差异变量分布不均，故需采用OPLS-DA对结果进行分析。见图3。通过7折交叉验证(7-fold cross validation)得到R2Y(模型对分类变量Y的可解释性)和Q2(模型的可预测性)，通过置换检验(permutation test)，随机多次(次数n=200)改变分类变量Y的排列顺序，建立对应的OPLS-DA模型获取随机模型的R2Y和Q2值。结果表明，对照组和研究组基线时的R2Y、Q2分别为0.96、-0.30(正离子模式)和0.98、-0.25(负离子模式)；研究组基线时和研究组经rTMS干预后的R2Y、Q2分别为0.93、-0.21(正离子模式)和0.97、0.12(负离子模式)。总体来说模型具有良好的稳健性。

注：A-正离子模式，B-负离子模式

注：组1与组2：A-正离子模式，B-负离子模式；组2与组3：C-正离子模式，D-负离子模式

2.4 差异代谢物筛选 根据OPLS-DA模型获得VIP值，筛选出VIP>1且t检验(Student’st-test)P<0.05的差异代谢物。与对照组比较，研究组基线时血浆中共筛选出34个差异代谢物(正离子模式11个，负离子模式23个)。其中，可替宁、2-甲基吡啶、L-谷氨酸、1H-吡咯-2-甲醛、羟基烟碱、5′-羟基烟碱等15个代谢物下调(P<0.05)，亮氨酰-异亮氨酸、3-吲哚乙腈、红藻胶等19个代谢物上调(P<0.05)。见表2。

表2 正负离子模式下两组基线时的差异代谢物

与研究组基线时比较，研究组经rTMS干预后血浆中共筛选出36个差异代谢物(正离子模式29个，负离子模式7个)。其中，(±)-赤型异亮氨酸、D-脯氨酸、次黄嘌呤等33个代谢物下调(P<0.05)，同型半胱氨酸、对苯二甲酸及15-棕榈酸甲酯上调(P<0.05)。见表3。

表3 正负离子模式下研究组基线时和研究组经rTMS干预后的差异代谢物

2.5 差异代谢物的代谢通路分析 利用MetaboAnalyst平台(https://www.metaboanalyst.ca/)对组1与组2差异代谢物进行通路综合分析(包括富集分析和拓扑分析)，找到与差异性代谢物相关性最高的关键通路[12]，结果以气泡图展示。见图4。根据图4-A，正离子模式下共筛选出6条组1与组2的差异代谢通路，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，亚油酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨基酰基-tRNA生物合成，精氨酸和脯氨酸的代谢。根据图4-B，负离子模式下也筛选出6条组1与组2的差异代谢途径，包括脂肪酸生物合成，花生四烯酸代谢，咖啡因代谢，α-亚麻酸代谢，硫代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢。正负离子模式检测下，主要涉及氨基酸代谢和能量代谢，其中氨基酸代谢途径检测到的差异性代谢物最多。同理，对组2与组3差异代谢物进行通路的综合分析。根据图4-C，正离子模式下共筛选出6条组2与组3的差异代谢通路，包括氨基酰基-tRNA生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，生物素代谢，及组氨酸代谢。根据图4-D，负离子模式下也筛选出6条组2与组3的差异代谢途径，包括氮代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，牛磺酸和亚牛磺酸代谢，硫代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，果糖和甘露糖代谢。

注：组1与组2：A-正离子模式，B-负离子模式；组2与组3：C-正离子模式，D-负离子模式

3 讨论

MA依赖者心理渴求重、戒断困难，复吸率一直居高不下[13]。发现治疗新技术及新模式，是MA依赖治疗成功的关键。rTMS是一种广泛运用的非侵入性临床治疗技术，通过调节大脑神经电生理活动达到治疗精神疾病的目的[14]。Liu T等[4]发现高频rTMS治疗女性依赖者可耐受且有效。本研究为保证试验准确性，为急性脱毒后不愿进行常规脱毒的MA依赖者进行为期4周rTMS治疗，发现OCDUS总分及毒品的影响、渴求的频率及毒品失控评分均较治疗前降低。因此，说明rTMS可降低MA依赖者对MA的渴求程度。

目前，国内外对基于上调LC-MS的MA依赖及其血浆的代谢组学研究鲜见报道。代谢物作为生物体表型的直接体现，可以放大表达基因、转录、蛋白质层面的差异[10]。本研究采用非靶向代谢组学技术，探讨MA依赖患者给药前后血浆中代谢物的变化，与文献报道的相关代谢分析[1]比较，本研究建立的方法从正负模式系统全面的代谢通路进行分析。本研究QC检测证实中所获得的代谢产物能够真实反映样本组间的生物学差异，采卡值标准结合OPLS-DA模型筛选出组间差异代谢物，并通过聚类分析说明本研究中所筛选的代谢物合理。

与对照组相比，研究组基线时在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，亚油酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等方面发生不同程度的紊乱。其中天冬氨酸在酶的催化作用下发生转氨基作用生成天冬酰胺，同时将谷氨酰胺转变为谷氨酸。谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性递质之一，兴奋性毒性与胞外谷氨酸浓度增加，过度激活受体有关。正常情况下，细胞膜上谷氨酸转运体能逆浓度梯度从胞外向胞内摄取谷氨酸，维持胞外谷氨酸浓度的动态平衡。谷氨酸转运体有多种亚型，已有研究报道，两种主要的谷氨酸转运体：囊泡膜谷氨酸转运体和质膜型谷氨酸转运体1，在防治MA引起的神经损伤中具有重要作用[15]。结合本研究结果，进一步证实谷氨酸代谢在MA依赖中可能起着关键的作用。本研究发现rTMS治疗后氨基酰基-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等方面进行一定程度调节。氨基酰基-tRNA生物合成主要反映出细胞中蛋白质的生物合成；脯氨酸是谷氨酸的代谢衍生物，同时也是生糖氨基酸，可代谢生成三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸；精氨酸参与鸟氨酸循环，促进尿素的形成[16]。根据研究组基线时和研究组经rTMS干预后正负离子模式数据分析可知，主要涉及氨基酸代谢和能量代谢，其中氨基酸代谢途径检测到的差异性代谢物最多。因此，rTMS可能通过氨基酸代谢降低MA依赖的渴求程度。

本研究所建立的方法能全面系统地鉴定出与MA依赖及其治疗相关的代谢物和代谢通路，同时也存在一定局限性，如各组样本量较小。研究结果有助于阐明MA依赖的发病机制，为临床诊断及治疗提供思路。