益心舒片HPLC-ELSD 指纹图谱

齐元春 郑艳春 褚 莉王春民∗

（1.承德医学院，河北 承德067000； 2.颈复康药业集团有限公司，河北 承德067000； 3.河北省中药新辅料工程技术研究中心，河北 承德067000）

益心舒片源于金元时期李杲所著《内外伤辨惑论》 中的生脉散，由人参、麦冬、黄芪、五味子、丹参、川芎、山楂7 味药组成，具有益气复脉、活血化瘀、养阴生津的功效。其中，人参、丹参为君药，黄芪、麦冬、川芎为臣药，五味子、山楂为佐药［1］。

目前关于益心舒片质量研究的文献报道较少，主要以人参、丹参、五味子中化学成分的含有量测定为主［2-5］。指纹图谱具有信息量大、特征性强、整体性等特点［6-7］，于桂芳等［8］建立了一种益心舒片以五味子和丹参中的化学成分为主要指标的HPLC 指纹图谱，确定29 个共有峰，并指认出12 个共有峰，12 个共有峰成分主要来自丹参、五味子，但发现山楂、麦冬、人参药材对共有峰几乎没有贡献，不能反映君药人参，臣药黄芪、麦冬所含成分的整体质量。因此，本实验参照2015 年版《中国药典》（一部）［9］及相关文献［10-14］，建立了以人参、黄芪、五味子和丹参中化学成分为主要指标的HPLC-ELSD 指纹图谱，通过共有峰归属和指认控制益心舒片的质量。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Alltench 3300 型蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）；A-10 型全自动空气源（北京中惠普分析技术研究所）；Milli-Q 超纯水系统（美国 Millipore 公司）；MS204TS／02 型电子天平 ［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；XSE205DU 型电子分析天平［十万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；HWS26 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52-99 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试剂与药物 对照品人参皂苷Rg1（批号110703-201128，纯度 93.4%）、人参皂苷 Re（批号 110754-201324，纯度 92.7%）、人参皂苷 Rf（批号 11719-201104）、人参皂苷 Rb1（批号110704-201223，纯度95.9%）、人参皂苷 Rb2（批号 111715-201203，纯度93.8%）、人参皂苷 Rb3（批号 111686-201203，纯度94.3%）、人参皂苷 Rd（批号 111818-201302，纯度94.2%）、五味子醇甲（批号110857-201412）、隐丹参酮（批号110852-200806，纯度98.7%）、丹参酮ⅡA（批号110766-200619）、五味子乙素（批号110765-201311，纯度98.8%）均购于中国食品药品检定研究院；丹参酮Ⅰ（批号110867-200406）购于中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rg2（批号17072601，纯度≥98%）、人参皂苷Rh1（批号19022802，纯度≥98%）、人参皂苷Rc（批号18092002，纯度≥98%）均购于成都普菲德生物技术有限公司；黄芪甲苷（批号5081，纯度97.2%）购于上海诗丹德标准技术服务有限公司。益心舒片（颈复康药业集团有限公司，批号 930039、930040、930042、930043、930044、930045、930046、930047、830294、830295）。乙腈、甲醇均为色谱纯，均购于美国Mreda 公司；甲醇为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；水为Milli Q 设备自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min，79%～79% B；30～40 min，79%～71.5% B；40～42 min，71.5%～66% B；42～50 min，66%～67% B；50～55 min，67%～62% B；55～65 min，62%～63% B；65～68 min，63%～57% B；68～75 min，57%～55% B；75～100 min，55%～30% B；100～105 min，30%～10% B）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量10 μL；蒸发光检测器参数，漂移管温度90 ℃；载气体积流量1.0 L／min；增益值2。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品加甲醇分别制备成含人参皂苷Rg1 1.002 mg／mL、人参皂苷Re 0.543 mg／mL、人参皂苷Rf 0.305 mg／mL、人参皂苷Rb1 0.495 mg／mL、人参皂苷Rg2 0.234 mg／mL、人参皂苷Rh1 0.36 mg／mL、人参皂苷Rc 0.25 mg／mL、人参皂苷Rb2 0.377 mg／mL、人参皂苷Rb3 0.994 mg／mL、人参皂苷Rd 0.566 mg／mL、黄芪甲苷0.459 8 mg／mL、五味子醇甲0.262 mg／mL、隐丹参酮0.097 6 mg／mL、丹参酮Ⅰ0.098 mg／mL、丹参酮ⅡA0.1 mg／mL、五味子乙素0.081 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取益心舒10 片，除去包衣，研细，取约2 g 至索氏提取器中，加75%甲醇150 mL，水浴加热回流4 h，滤过，蒸干，残渣加水15 mL，微热使溶解，用水饱和正丁醇，振摇提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇溶液，用氨试液洗涤2 次，每次40 mL，弃去氨试液，将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 参照2015 年版《中国药典》 益心舒片提取制备方法，分别制备缺7 味药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，以人参皂苷Rd 为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD＜4%，相对保留时间RSD＜0.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，以人参皂苷Rd 为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD＜4%，相对保留时间RSD＜0.6%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以人参皂苷Rd 为参照峰，测得各共有峰相对峰面积RSD＜4%，相对保留时间RSD＜0.4%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立

2.4.1 共有峰标定 选取人参皂苷Rd 为参照峰（S），色谱图中各色谱峰保留时间与参照峰（S）保留时间的比值为相对保留时间进行计算，结果见图1。其中34 个峰为10批样品所共有，标定为共有峰。

2.4.2 相似度评价 共有峰通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 年版）分析，中位数法建立对照指纹图谱，见图1。10 批样品指纹图谱与对照图谱的相似度分别为0.991、0.989、0.995、0.989、0.984、0.974、0.998、0.978、0.991、0.986，均在0.97 以上。

2.4.3 共有峰归属 分别吸取7 种阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL，色谱图见图2。通过阴性比较，共有峰1～14 号、16 号、18 号、19 号、21 号、24号、25 号、28 号、29 号峰归属人参，15 号归属黄芪，23号、31 号、32 号、33 号归属丹参，17 号、20 号、22 号、26 号、27 号、30 号、34 号归属五味子；人参对色谱图的贡献最大，其次为五味子、丹参以及黄芪中的黄芪甲苷。

图1 10 批样品ELSD-HPLC 指纹图谱

图2 共有峰归属

2.4.4 共有峰指认 通过对照品对共有峰进行指认，共确定16 个，见图3。

3 讨论

蒸发光检测器具有通用性，不受流动相梯度影响，基线稳定，还能用于未知物检测的特点［15］。人参皂苷在203 nm波长下建立益心舒片指纹图谱，基线发生较为严重的漂移，色谱峰杂乱，干扰较为严重，不能用于质量控制。因此，采用HPLC-ELSD 法，建立益心舒片指纹图谱，很好的解决了以上问题。

同HPLC 指纹图谱相比，HPLC-ELSD 指纹图谱增加了对人参皂苷、黄芪甲苷等皂苷类成分的整体质量控制，缺乏对于阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B 等酚酸类成分的质量控制。因此，将两者相结合的方式能够更加准确、全面的反映和控制益心舒片的质量。

指纹图谱色谱峰分离过程中，为了增加人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1 与人参皂苷Rc 的分离度，42～50 min 采用66%～67%水相梯度洗脱，能够在短时间内得到较好的分离度；为了增加人参皂苷Rb3 和黄芪甲苷的分离度，55～65 min采用62%～63%水相的洗脱方式，能够在短时间内达到较好的分离度。

本研究对液相色谱柱的类型［Kromasil 100-5-C18、Inertsil ODS-3、Agilent 5 TC-C18（2）］，柱温（25、30、35 ℃）、流动相（乙腈-0.02% 磷酸、乙腈-水、甲醇-水）进行考察，最终确定“2.1”项下条件。

实验还对蒸发光检测器漂移管温度（75、80、90、100 ℃）和载气体积流量（1.0、1.5、2.0 L／min）进行考察，最终确定蒸发光检测器温度为90 ℃，载气体积流量1.0 L／min。考察了超声提取，索氏提取后正丁醇萃取2 种提取方法，以及不同提取溶剂（50%、75%、100%甲醇）、提取时间（2、3、4、5 h）的提取效果，发现索氏提取后正丁醇萃取最好；50%甲醇提取，整体峰面积较低，提取不完全，75%甲醇提取时，整体峰面积最大，提取最为完全，而100%甲醇提取时，以人参为主的皂苷类成分峰面积与75%甲醇提取时无差异，但以丹参酮ⅡA、隐丹参酮、五味子醇甲和五味子乙素为主的黄酮类成分峰面积明显更低。另外，75%甲醇索氏提取时4 h 内提取完全，为最佳提取时间。

本研究在进行提取溶剂考察时发现，100%甲醇提取与75%甲醇提取相比，以人参为主的皂苷类成分峰面积无明显差异，但以丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、五味子醇甲、五味子乙素为主的脂溶性成分峰面积明显更低，可能是由于人参皂苷在水和甲醇中均能较好地溶解，所以2 种溶剂提取效果无明显差别。五味子和丹参中的脂溶性成分易溶于甲醇，难溶于水，可能是由于益心舒片中皂苷类成分的存在增加其在水中的溶解度，而且75%甲醇提取效果优于100%甲醇，具体原因有待进一步研究。

图3 各成分ELSD-HPLC 图谱