益肾降浊胶囊治疗慢性肾功能衰竭的实验研究

张 宸 ，高贤娴 ，杨 楠 ，王丹妮 ，洪 铁 ，

（1.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；2.吉林省中医药科学院，长春130012；）

慢性肾功能衰竭（Chronic renal failure，CRF）又简称慢性肾衰，可由各种疾病如肾小球肾炎、泌尿系统先天畸形、遗传性疾病等逐渐发展而来[1]。CRF进展缓慢，但病程发展一般不可逆，而且病程的某一阶段可呈进行性发展和加重，直至发展成尿毒症。目前患得该病的人数达到数千万，临床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治疗措施以缓解CRF症状并延缓病程发展[2～3]。近年来，CRF也引起了中医药研究者的关注，益肾降浊胶囊具有补肾健脾、益气利水的功效，又可以逆降清浊、活血化瘀。本文通过制备CRF大鼠模型并灌胃给予益肾降浊胶囊进行干预治疗，探讨益肾降浊胶囊对CRF的保护作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，体质量180～200g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001。大鼠饲养于SPF级清洁环境中，标准饲料喂养，自由进食，适应一周。

1.2 实验药物

益肾降浊胶囊由吉林省中医药科学院提供，该研究中使用的每g药膏相当于生药约4.55g；肾衰宁胶囊由云南理想药业有限公司生产。

1.3 实验试剂

Scr测定试剂盒、BUN测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.4 实验仪器

代谢笼，上海泽雅科教仪器有限公司；BS-124S电子天平，北京塞多利斯系统有限公司；微量移液器，赛默飞世尔仪器有限公司；代谢笼，上海泽雅科教仪器有限公司；超纯水系统（AFZ-1002-U），艾科普仪器有限公司；TGL-16B离心机，上海安亭科学仪器厂；全波长酶标仪，Biotek公司；倒置显微镜，德国LEICA公司。

2 实验方法

2.1 阳离子化牛血清白蛋白的制备

按照文献[4]的方法，取67ml的无水乙二胺液，加入500ml双蒸水，再加入6mol/l的盐酸350ml，调整PH至4.75，冷却至25℃，进行搅拌，再加入天然牛血清白蛋白（N-BSA）5g溶于25ml重蒸馏水的溶液，搅拌完全后再加入1.8g炭化二亚胺盐酸盐（EDCHCI）维持25℃，持续搅拌2h，保持PH值4.75，最后加4mol/l的醋酸缓冲液30ml，终止反应，即得到等电点提高的C-BSA溶液，将C-BSA溶液置于透析袋中，用4℃的双蒸水透析72h（3～5h换水一次），冷冻干燥后，即得BSA冻干粉。密封保存于80℃冰箱内，注射前用0.01mol/l的PH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）配制成溶液。

2.2 构建模型

按照文献[5]的方法建立膜性肾病模型，实验动物适应性喂养一周后，测24h尿蛋白，选择24h尿蛋白正常的SD大鼠60只，10只作为空白对照组，另外50只进行预免疫和致病免疫。预免疫：C-BSA100mg溶于3.75mlPBS中，加入26.25ml弗氏不完全佐剂充分混合乳化，除正常组外，在其余大鼠的双侧腋下、背部及腹股沟多个位置皮下注射（每只大鼠注射0.3ml，每点注射不超过0.05ml），每隔1日进行1次。致病免疫：在预免疫一周后，开始正式免疫，大鼠每隔1日尾静脉注射C-BSA3.5mg/只，每周注射3次，连续注射4周。

2.3 动物分组及给药

未进行模型制作的10只大鼠作为空白对照组，将模型大鼠分为模型对照组、肾衰宁组、益肾降浊胶囊高、中、低剂量组，每组10只。每天灌胃给药一次，正常对照组及模型对照组给予同体积蒸馏水，连续给药6周。

2.4 观察及检查指标

2.4.1 大鼠一般情况

治疗完成后，观察各组大鼠的一般生存状况，包括精神状态、外观、饮食状况、死亡情况等。

2.4.2 24h尿蛋白量

分别于造模结束第0周、第2周、第4周、第6周将大鼠置于代谢笼中，收集大鼠的24h尿液，并记录尿量，测定24h尿蛋白量。

2.4.3 血清肾功能指标检测

实验结束后腹主动脉取血，检测血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的含量，具体方法按照试剂盒标示方法进行。

2.4.4 肾脏组织病变的观察

取大鼠右侧肾脏置于4%的多聚甲醛溶液固定72h，然后进行石蜡包埋、切片、展片和蜡脱水化处理，在常规HE染色后通过导致光学显微镜观察肾脏组织形态结构的变化。

2.4.5 SOD活性和MDA含量的测定

取左侧肾脏、加入适量裂解液进行研磨匀浆，离心后取上清液，测定肾脏组织的超氧化物歧化酶SOD活性和MDA含量，具体方法按照试剂盒标示方法进行。

2.5 统计方法

收集数据，采用SPSS17.0软件进行分析，根据检验数据资料的正态性和方差齐性，定量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05时差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

空白对照组的大鼠精神状态佳，饮食饮水正常，毛色光泽顺滑，体重逐渐增加。在造模过程中未出现大鼠的死亡，但模型组的大鼠呈现精神不振，反应迟钝，食量明显减少，饮水大量增加，尿量明显增多，毛色发黄、无光泽。经益肾降浊胶囊给药治疗后，各药物组大鼠的精神状态随着用药时间的延长而精神状态逐渐变好，活动强度增加，进食量增加明显。

3.2 益肾降浊胶囊对CRF大鼠24h尿蛋白定量的影响

造模结束后，在进行给药治疗前模型组与各给药组24h尿蛋白量无显著性差异（P＞0.05）；与空白对组相比，模型对照组与给药组24h尿蛋白量明显增加（P＜0.01）。经益肾降浊胶囊治疗6周后，各组大鼠的24h尿蛋白明显低于模型组，结果具有显著性差异（P＜0.01）。 结果见表 1。

表1 各组大鼠不同时段24h尿蛋白定量

3.3 益肾降浊胶囊对血清肾功能监测指标的影响

与空白对照组相比，CRF模型组大鼠血清中的Scr与BUN含量显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，益肾降浊胶囊给药组组均能降低CRF模型大鼠的Scr和BUN的含量，具有显著性差异（P＜0.05）。结果见表2。

表2 益肾降浊胶囊对CRF大鼠血清中Scr和BUN的影响

3.4 益肾降浊胶囊对CRF大鼠肾组织病理学的影响

通过对各组大叔肾组织病理分析显示，空白对照组大鼠的肾组织肾小球结构与数量正常，肾小管结构正常，官腔未见萎缩。模型组大鼠的肾组织存在局部肾单位萎缩、肾小管上皮细胞空泡变性，肾小球囊腔及肾小管存在明显扩张，肾间质大量炎性细胞浸润。经益肾降浊胶囊治疗后，上述病理变化较模型组显著改善。结果见图1。

3.5 益肾降浊胶囊对CRF大鼠肾脏组织SOD活性和MDA含量的影响

图1 益肾降浊胶囊组对CRF大鼠病理变化的影响（HE 400）

与空白对照组相比，模型组的SOD活性显著降低（P＜0.01）；经益肾降浊胶囊治疗6周后，与模型组相比，各治疗组的SOD活性均呈现上升趋势。与空白对照组相比，模型组的MDA含量明显高于空白对照组，有显著性差异（P＜0.01）；与模型组相比，益肾降浊胶囊给药组的MDA的含量降低明显，具有显著性差异。 （P＜0.05）。 结果见表 3。

表3 益肾降浊胶囊对CRF大鼠抗氧化酶和MDA含量的影响

4 讨论

本实验对SD大鼠尾静脉注射C-BSA 4周后，动物出现萎靡不振、脱毛、摄食减少等反应，出现大量蛋白尿、血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）显著增加，说明肾功能严重受损。并且在光学显微镜下观察到肾小球、肾小管的病变，说明膜性肾病诱发大鼠慢性肾衰是成功的。

CRF主要病机是气机升降失常[6]，中药对于慢性疾病的治疗有独特之处，中医认为该病属于“关格”、“癃闭”、“水肿”等范畴[7～8]。 因此，对于 CRF 的治疗，在健脾补肾、祛湿化浊、活血化瘀的基础上，还要考虑运用药物的四气五味、升降浮沉来恢复脏腑的气机的升降特性。益肾降浊胶囊是吉林省中医科学院临床专家以传统中医药理论为指导，在长期临床实践中总结出的方剂。该药物由熟地黄、杜仲、补骨脂、仙灵脾、女贞子、红参、黄芪、白术等十二味中药组成，方中以熟地黄补血养阴、益肾填精，杜仲温补肝肾，二者相伍，双补肾之阴阳，共为君药。补骨脂补肾壮阳、固精暖脾，仙灵脾补肾壮阳，黄芪健脾补气，利水消肿，红参大补元气，四者即可助君药增强补肾温阳之力，又可健脾益气、利水消肿，共为臣药。其他六种中药助君臣增强补肾健脾、益气利水之效，又可泥降清浊解毒，兼有活血化瘀之功，全方共奏补肾健脾、降逆清浊之效。

本文通过对CRF大鼠采用益肾降浊胶囊治疗后，检测各组大鼠的肾功能指标，结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠的24h尿蛋白量，血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平显著升高。经过益肾降浊治疗后，治疗组的大鼠的肾功能指标显著降低。通过对大鼠组织进行病理分析显示，益肾降浊胶囊能够明显改善肾组织的萎缩、扩张等情况。同时，益肾降浊胶囊能够提高SOD活性、降低MDA，具有明显的抗氧化作用。氧化应激是肾脏疾病进展的重要因素，益肾降浊胶囊能够增加机体中SOD活性从而提高机体清除氧自由基的能力，减轻自由基对肾小球的损伤，从而延缓慢性肾衰的进程。

综上所述，益肾降浊胶囊可改善大鼠一般生存状态、改善肾功能、抑制肾脏组织病变，产生抗氧化作用，说明益肾降浊胶囊能够缓解大鼠慢性肾功能衰竭。