组方优化的阳和胶囊对木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎的作用研究

王丹妮 ，张 宸 ，高贤娴 ，吴 岩 ，洪 铁 ，

(1.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；2.吉林省中医药科学院，长春130012）

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种逐渐进展的关节慢性疾病，系由于劳损、创伤、肥胖等因素引起的关节软骨损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎等，是一种关节整体的退行性病变。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。其病理特征主要在于对关节软骨，软骨下骨，韧带，关节囊，滑膜和关节周围肌肉的影响。[1，2]组方优化的阳和胶囊是吉林省中医药科学院骨科专家以传统中医药理论为指导，根据长期临床实践总结出的经验方。全方由补骨脂、熟地、牛膝、生姜、麻黄、肉桂、白芥子、延胡索等多味中药组成，是吉林省中医药科学院院内制剂，组方优化的阳和胶囊在多年临床治疗骨关节炎疾病方面取得了较好的疗效，如老年原发性骨质疏松症[3，4］、腰椎间盘突出症[5]等。骨关节炎模型分为诱导性与自发性两大类，其中在大鼠膝关节腔内注射木瓜蛋白酶或其混合溶液是化学因素诱导的膝关节骨关节炎常用模型之一[6，7]。本研究探讨了组方优化的阳和胶囊对木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎的影响，以期为组方优化的阳和胶囊治疗骨关节炎提供更多理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠，雄性，50只，体质量220～250 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，将动物于动物室适应性饲养一周，温度为20～24℃，湿度为40%～70%，12h明暗交替照明，给予维持饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂

木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸由北京索莱宝科技有限公司生产；盐酸氨基葡萄糖胶囊由北京康必得药业有限公司生产；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒、大鼠白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)ELISA试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供；糖胺多糖（GAGs）试剂盒由上海通蔚科技有限公司生产。

1.3 实验仪器

全波长酶标仪，Biotek公司；手持式高速匀浆机，上海巴玖实业有限公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；3-18k低温高速冷冻离心机，Sigma公司；XPX-9052 MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司。

2 方法

2.1 分组给药与动物模型的建立

将50只Wistar雄性大鼠，按体重随机分为6组，模型组10只，其余各组8只。分别为正常对照组，模型 （10%木瓜蛋白酶+0.03mol/L L-半胱氨酸混合溶液）组，阳性对照盐酸氨基葡萄糖（0.13g/kg）组，组方优化的阳和胶囊高剂量组、中剂量组、低剂量组。大鼠分笼饲养。

将10%木瓜蛋白酶与0.03 mol/L的L-半胱氨酸按1∶1混合静置30 min后备用。于实验第0，3，6天，在模型组，阳性对照组，组方优化的阳和胶囊高、中、低剂量组大鼠膝关节腔内注入0.2 mL木瓜蛋白酶混合溶液诱导大鼠骨关节炎模型。正常对照组注射等体积生理盐水。在末次膝关节腔内注射木瓜蛋白酶混合溶液后，阳性对照组及各给药组分别灌胃给予相应浓度受试药，模型组、正常对照组灌胃给予等体积0.5%CMC-Na，每日一次，共计给药4周。

2.2 观测指标

2.2.1 大鼠一般情况

实验期间观察各组大鼠毛发、进食量、精神状态及活跃程度等一般情况。

2.2.2 大鼠双膝关节宽度变化

测量造模前、给药前，以及给药第 1、2、3、4 周的大鼠膝关节宽度（mm），每只大鼠测量3次取平均值，按照以下公式计算关节肿胀度：

关节肿胀度(mm)=致炎后（给药后）踝关节宽度(mm)-致炎前踝关节宽度(mm)

2.2.3 大鼠膝关节腔灌洗液中 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ的含量测定

大鼠麻醉后双膝关节腔内注射生理盐水进行灌洗，将关节灌洗液在4℃条件下1500r/min离心15min，分离上清后进行分装，-80℃冻存备用。取其上清液按照ELISA试剂盒说明书的要求测定灌洗液中IL-1β、IL-6及 TNF-ɑ的含量。

2.2.4 大鼠关节滑膜组织中GAGs含量测定

取大鼠双膝关节滑膜组织，液氮速冻后转-80℃冻存备用。取适量滑膜组织，加入冰生理盐水，置于冰浴中用组织匀浆器制成2%滑膜组织匀浆，离心取上清液，离心条件4℃下，3500 r/min，10 min。取适量上清液，采用二甲基亚甲蓝分光光度法根据说明书的指导测定关节滑膜组织中糖胺多糖（GAGs）的含量。

2.3 统计学处理

全部实验数据均采用SPSS 17.0软件进行。根据检验数据资料的正态性和方差齐性，各组数据均用±s表示，组间比较采用t检验比较差异的显著性。P＜0.05即有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

实验开始前，各组大鼠膝关节活动度正常，各关节局部无肿胀；大鼠活动敏捷，灵敏度佳；毛发光滑，精神状态正常，饮食、饮水正常。造模过程中未出现大鼠死亡。造模结束后各造模组大鼠均出现精神不振，膝关节稍有跛行现象。治疗4周后正常对照组大鼠膝关节活动正常，饮食、饮水正常，毛色光亮，反应灵敏；模型组大鼠均出现膝关节局部肿胀，少动，饮食、饮水减少，反应迟纯等现象；其余各给药组大鼠膝关节肿胀程度，反应敏捷性等均有不同程度的减轻，其中阳性对照盐酸氨基葡萄糖组及组方优化的阳和胶囊高剂量组恢复程度较好。

3.2 大鼠双膝关节宽度变化结果

实验结果表明，正常对照组给生理盐水前后膝关节直径无变化（P＞0.05）。与正常对照组相比，各造模组大鼠膝关节直径显著升高（P＜0.01），各造模组之间比较无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，阳性对照盐酸氨基葡萄糖组、组方优化的阳和胶囊高剂量组的大鼠膝关节直径显著降低（P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组的大鼠膝关节直径明显降低（P＜0.05），结果见表1。

表1 组方优化的阳和胶囊对大鼠膝关节肿胀度的作用结果（x±s）

3.3 大鼠膝关节腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的结果

与正常对照组相比，模型组大鼠膝关节腔灌洗液中 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ 含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药对照组、组方优化的阳和胶囊高剂量组大鼠膝关节腔灌洗液中的 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ含量显著降低（P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组的 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ 含量明显降低 （P＜0.05），结果见表 2。

表2 组方优化的阳和胶囊对大鼠膝关节腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-ɑ 含量的影响结果

3.4 大鼠关节滑膜组织中GAGs含量测定

与正常对照组相比，模型组大鼠关节滑膜组织中GAGs含量显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药对照组、组方优化的阳和胶囊高剂量组关节滑膜组织中的GAGs含量显著升高（P＜0.01），组方优化的阳和胶囊中、低剂量组关节滑膜组织中的GAGs含量明显升高（P＜0.05），结果见表 3。

表3 组方优化的阳和胶囊对大鼠关节滑膜组织中GAGs含量的影响结果

4 讨论

骨关节炎 （Osteoarthritis，OA）是以关节疼痛、僵硬、麻木和功能障碍为主要临床表现的疾病，好发于膝关节、手指关节等部位，病理改变以关节软骨退变和骨质增生为基本特征。随着全球人口老龄化及肥胖人口的增加，骨关节炎的发病率也逐渐增加，已成为加重经济负担、影响人们生活质量的社会性问题[[]]。

骨关节炎的关节软骨退变和骨质增生与炎症反应密切相关，炎症因子的大量释放，造成滑膜和关节周围组织炎症、软骨破坏及骨质增生等病变。炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-ɑ等均参与骨关节炎的病理变化过程。IL-6是引起骨关节炎症的基础因素，在早、中期骨关节炎患者关节液中存在异常高水平[[]]。IL-1是骨关节炎发病过程中的核心因子，由巨噬细胞产生，可在转换酶的作用下生成活性更高的IL-1β，进一步加重关节的炎症反应与局部疼痛[1]。TNF-ɑ在骨关节炎的基本病理过程中起着直接促进软骨基质降解及软骨细胞破坏的作用[2]。IL-6与IL-1β、TNF-ɑ发挥协同作用，加重关节炎症。在本研究中我们发现模型组 TNF-ɑ、IL-6、IL-1β 的含量均升高；与模型组相比，组方优化的阳和胶囊治疗后，TNF-ɑ、IL-6、IL-1β均有所下降，其中以组方优化的阳和胶囊高剂量组治疗效果最为明显。

软骨中蛋白聚糖（Proteoglycan，PG）的合成不足是软骨退变的主要表现之一[10]。软骨细胞外基质尤其是蛋白聚糖的缺失，可引起软骨细胞破坏，导致关节疼痛和功能障碍。糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAGs）是构成蛋白聚糖的主要成分，是蛋白聚糖的决定性功能基团。已有研究表明，在骨关节炎疾病进程中发现糖胺多糖的合成受阻、降解增加[11]。实验结果显示模型组大鼠软骨组织中糖胺多糖的含量显著减少，与模型组相比组方优化的阳和胶囊能显著提高软骨组织中糖胺多糖的含量，其中以组方优化的阳和胶囊高剂量组治疗效果最为明显。

综上所述，组方优化的阳和胶囊在缓解木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎的同时，降低了膝关节腔灌洗液中 IL-1β、IL-6、TNF-ɑ的表达，提高了软骨组织中糖胺多糖的含量。提示组方优化的阳和胶囊治疗木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎的机制可能是下调促炎因子的表达及增加软骨组织中糖胺多糖的含量来治疗骨关节炎。关于组方优化的阳和胶囊治疗木瓜蛋白酶诱导的大鼠骨关节炎的作用机制有待进一步深入研究。