鹿茸多肽对冈田酸诱导的小鼠海马神经元HT22细胞损伤模型中PI3K、AKT、Caspase-9表达的影响

2020-03-27 03:59刘玥欣任吉祥兰天野王晋冀许佳明律广富叶豆丹黄晓巍
人参研究 2020年1期
关键词:鹿茸多肽存活率

林 贺 ,刘玥欣 ,任吉祥 ,兰天野 ,王晋冀 ,徐 岩 ,许佳明 ,律广富 ,叶豆丹 ,黄晓巍

(1.长春中医药大学,长春130117;2.长春中医药大学附属医院,长春130021)

轻度认知功能障碍(MCI)是正常脑老化发展为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)过渡状态,由于AD是不可逆转的,因此对MCI进行研究,提早进行干预,对于降低AD的发病率具有重要意义[1]。冈田酸(OA)是磷酸酯酶抑制剂,能够引起全局化的磷酸化水平提高,常用于体外MCI模型的制备[2~3]。鹿茸多肽是鹿茸的主要药效物质,能够催生神经元的生成和干细胞的分化,能够更快促进神经轴突的生长,对神经系统有滋养的作用[4]。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶 B(AKT)、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)等是脑组织PI3K/AKT信号通路的重要信号因子,是鹿茸多肽通过PI3K/AKT信号通路治疗MCI的潜在靶点[5~6]。本实验通过OA诱导制备HT22细胞损伤模型,观察鹿茸多肽对受损细胞内 PI3K、AKT、Caspase-9表达的影响,探讨相关作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与仪器

鹿茸多肽,长春中医药大学制备(每1g含生药量28.7g);OA,上海源叶生物科技有限公司,批号:S43785;MTT,上海旭东海普药业有限公司,批号:030405;PI3K、AKT ELISA试剂盒,上海仁捷生物有限公司, 批号:YY-02217M、FC-98532Q;PI3K、AKT、Caspase-9、GAPDH一抗、HRP二抗,武汉三鹰生物技术有限公司,批号:10176-2-AP、20584-1-AP、10380-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP; 全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光法检测试剂盒、彩虹245广谱蛋白Marker、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒,北京索莱宝科技有限公司,批号:BC3711、PC0020、SW2010、PR1920、P1200-2;MCO-17型CO2孵箱,日本三洋公司,型号:EUI3748;倒置显微镜,日本 OLYMPUS 公司,型号:CHY4568;Multiskan FC酶标仪,美国Thermo公司;凝胶成像仪,英国UVItec公司,型号:Alliance Q9;电泳仪、电转仪、电泳槽,伯乐 bio-rad,型号:BE6085。

1.2 HT22细胞培养[7]

采用含10%FBS的DMEM/F12中培养HT22细胞,每3d更换50%新鲜培养液,于倒置显微镜下观察生长状态。培养2~4h后,HT22细胞逐渐贴壁伸展,形成轴突、树突相连的网状结构,培养7d至发育成熟。

1.3 HT22细胞损伤模型的建立[8]

选择生长状态良好、呈对数生长的HT22细胞,于5%CO2、37℃条件下,在孵箱中进行分组培养(细胞浓度为 1×106 个/ml,3ml/瓶)。 正常对照组给予DMEM/F12,DMSO对照组给予含 0.01%DMSO的DMEM/F12,OA细胞损伤模型组给予含10nmol/L OA的DMEM/F12,鹿茸多肽高、中、低剂量组给予含10nmol/L OA 的 鹿 茸 多 肽 (1000μg/ml、500μg/ml、50μg/ml),于 5%CO2、37℃条件下,孵箱培养 24h。

1.4 MTT法检测细胞存活率[9]

将HT22细胞接种在多聚赖氨酸包被过的96孔板上 (细胞浓度 1×105 个/ml,200μ/孔), 于 5%CO2、37℃条件下,孵箱培养7d后,正常对照组给予DMEM/F12,DMSO对照组给予含 0.01%DMSO的DMEM/F12,OA细胞损伤模型组给予含10nmol/L OA的DMEM/F12,鹿茸多肽高、中、低剂量组给予含10nmol/L OA 的 鹿 茸 多 肽 (1000μg/ml、500μg/ml、50μg/ml),继续培养 24h。

加入 MTT 工作液(10μl/孔,MTT 浓度为 0.5g/L),培养 4h,弃掉 MTT 工作液后加入 DMSO(100μl/孔),待蓝色甲臜结晶完全溶解后,检测各组细胞A595/A635吸光值,计算细胞生存率。细胞生存率=(实验组吸光值/正常对照组吸光值)×100%。

1.5 ELISA检测受损HT22细胞PI3K、AKT含量

按照ELISA试剂盒说明方法操作,测定450nm波长处吸光度 (A)值,计算各组实验细胞中PI3K、AKT含量。

1.6 Western Blot检测受损 HT22细胞 PI3K、AKT、Caspase-9表达水平

按照全蛋白提取试剂盒说明方法提取细胞蛋白,按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明方法测量蛋白含量,定量后放置于涡旋仪上摇匀,放入100℃水浴加热10min,放入-80℃储存。按照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明方法制胶,电泳时浓缩胶电压90V,分离胶电压110V,电泳完成后,进行转模,转模条件为100v,60min。结束转模后,TBST洗5min,共3次,5%脱脂牛奶封闭 1h,一抗 TGF-β1(1∶3000)、SMAD7(1∶2000)、PKC(1∶4000),4℃过夜,TBST 洗 10min1 次,洗 5min2次。HRP二抗常温摇床孵育1h,TBST洗5min,共3次,超敏ECL化学发光检测试剂盒A、B液等比例混匀后显色。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0统计分析软件进行数据处理,计量资料均采用表示,多组均数组间比较采用单因素方差分析,显著性水准P<0.05。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞存活率结果

细胞存活率检测结果说明,与正常对照组比较,OA细胞损伤模型组细胞存活率明显降低 (P<0.05);与OA细胞损伤模型组比较,鹿茸多肽高、中、低剂量组细胞存活率明显升高(P<0.05),结果见表1。

表1 细胞存活率结果(,n=6)

2.2 ELISA检测各组实验细胞内PI3K、AKT含量结果

ELISA检测结果说明,与正常对照组比较,OA细胞损伤模型组细胞内PI3K、AKT含量明显降低 (P<0.01或P<0.001);与OA细胞损伤模型组比较,鹿茸多肽高、中剂量组细胞内PI3K含量明显升高(P<0.05或P<0.01),鹿茸多肽高剂量组细胞内AKT含量明显升高(P<0.05),结果见表 2。

表 2 PI3K、AKT 含量结果(,n=6)

2.3 Western Blot检测各组实验细胞内 PI3K、AKT、 Caspase-9表达水平结果

Western Blot检测结果表明,与正常对照组比较,OA细胞损伤模型组细胞内PI3K、AKT、Caspase-9表达水平明显降低(P<0.01 或 P<0.001);与 OA 细胞损伤模型组比较,鹿茸多肽高剂量组细胞内PI3K表达水平明显升高(P<0.05 或 P<0.01),鹿茸多肽高、中剂量组细胞内AKT表达水平明显升高 (P<0.05或P<0.01),鹿茸多肽高剂量组细胞内Caspase-9表达水平明显升高(P<0.05),详见表 3,图 1。

表 3 PI3K、AKT、Caspase-9 表达水平结果(,n=6)

图1 PI3K、AKT、Caspase-9表达水平电泳图

3 讨论

PI3K/AKT信号通路广泛存在于各种细胞中,是神经存活信号转导的主要途径之一,参与并调节细胞生长、增殖、分化与迁移,是经典的抗凋亡、促存活的信号转导通路,也是调节大脑认知功能的关键信号通路[10~11]。 研究表明,MCI患者因脑内 PI3K/AKT信号通路受到抑制,进而引发神经细胞凋亡,影响记忆功能。激活PI3K/AKT信号通路,能够抑制神经细胞凋亡,改善能量代谢,促进神经功能的恢复,具有明显的脑保护作用[12]。Caspase-9是Caspase蛋白家族中一种重要的促凋亡因子,抑制Caspase-9的表达水平可产生明显的神经保护作用[13]。本研究通过体外细胞实验发现通过OA诱导的受损小鼠海马神经元HT22细胞内PI3K、AKT表达水平明显下调,而鹿茸多肽各剂量组均出现改善,说明鹿茸多肽能够在一定程度上提高PI3K、AKT表达、抑制Caspase-9表达,减少神经细胞凋亡。本研究结果表明,鹿茸多肽对OA诱导的鼠海马神经元HT22细胞损伤模型具有保护作用,作用机制可能与调控受损细胞内表达水平有关。

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