乳酸菌发酵香菇柄产γ-氨基丁酸培养基的优化

刘丽娜，王安建，李顺峰，田广瑞，魏书信，高帅平

（河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002）

香菇（Lentinus edodes）是我国特产食用菌，不仅味道鲜美、营养丰富，而且具有独特的香气，深受人们的喜爱[1]。2016年，我国香菇产量达898万t，居我国六大主要食用菌品种之首。香菇柄是香菇商品化处理的废弃物，占整个子实体质量的15%～30%。由于菇柄呈纤维化，适口性差，少量用作饲料，绝大部分都被废弃，全国每年废弃的香菇柄有数万吨，造成了极大的资源浪费。实际上香菇柄和菇盖同样是由香菇菌丝组成，含有丰富的蛋白质、糖类、维生素、矿物元素、膳食纤维等营养成分，其中谷氨酸在其蛋白质组成和游离氨基酸中均是含量最高的[2]，而谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）脱羧作用下可生成γ-氨基丁酸（GABA），它是一种功能性氨基酸。因此，香菇柄可作为开发功能食品的潜在基料。

在γ-氨基丁酸的食品开发中，采用生物技术方法获得的GABA制品具有广阔前景。除了传统的茶和米胚芽类制品外，米糠[3]、糙米[4]、乳制品类[5-6]等也被研究通过生物技术强化GABA含量，进而提高其附加值。目前已在大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌、曲霉等微生物中发现谷氨酸脱羧酶的存在，其中用乳酸菌生产GABA是被公认为安全、绿色天然的方法。很多乳酸菌都具有产GABA的能力，但在GABA生产上研究最多的乳酸菌是短乳杆菌、乳酸乳球菌、类干酪乳杆菌等[7]。

培养基优化是提高发酵产物产量的有效途径之一，培养基成分会影响乳酸菌合成GABA[8]。周青等[9]优化了Lactobacillus plantarumWZ011的发酵培养基，GABA产量达到5.814 g/L，比优化前提高了79%。孟和毕力格等[10]对Lactobacillus lacticWH11-1的发酵培养基进行了优化，采用优化后的培养基，发酵液中GABA含量达到了10.78 g/L。Park等[11]利用Lactobacillus brevisOPY-1发酵脱脂牛乳产GABA时，向培养基中添加大豆提取物，结果发现GABA产量从1.5 μg/g提高到424.67 μg/g。基于文献报道与分析，本研究从拓展香菇柄废弃物深加工综合利用的角度出发，采用低成本的香菇柄为培养基料，利用乳酸菌发酵产GABA，以期为新型富含GABA的功能性香菇制品的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

香菇柄原料，购自农贸市场，烘干后粉碎过40目筛，取筛下物密封保存备用。

植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum，GIM1.380），购自广东省微生物菌种保藏中心；MRS肉汤培养基，购自广东省环凯生物科技有限公司；GABA标准品，美国Sigma-Aldrich公司产品；甲醇、乙腈、乙酸钠、冰醋酸、氯甲酰芴甲酯（FMOC-Cl）均为色谱纯；四氢呋喃、谷氨酸、硼酸、硼砂、谷氨酸钠、乙醇、重蒸酚、次氯酸钠、葡萄糖、磷酸吡哆醛（PLP）、氯化钙等均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

FA2004C型分析天平，THZ-98AB型恒温振荡器，XM120-HR型快速水分测定仪，MJ-78A型高压灭菌锅，VS-840K-U型超净工作台，DF-10型恒温磁力搅拌器，GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱，UV-1800型紫外可见分光光度计，LD-Y300A型高速万能粉碎机，Advanced-I型艾柯超纯水机，FE20型pH计，H2050R型台式高速冷冻离心机，Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 发酵剂的制备

将植物乳杆菌植物亚种GIM1.380菌种接种在灭过菌的MRS肉汤培养基中，接种量2%，培养温度为37℃，150 r/min振荡培养16~20 h为活化一次，共活化培养3次，即得到发酵剂[12]。

1.2.2 乳酸菌发酵香菇柄产GABA发酵试验

将香菇柄粉与去离子水按料液比1∶20（g/mL）混匀后作为基础发酵培养基，灭菌冷却至室温，接入4%发酵剂，发酵温度37℃条件下，150 r/min振荡培养发酵60 h，发酵结束后测定生成GABA的产量[13]。

1.2.2.1 发酵培养基成分的确定

在基础发酵培养基（香菇柄粉与去离子水按料液比1∶20(g/mL)混匀）中分别加入不同含量谷氨酸钠（2、4、6、8、10、12 g/L）、不同含量氯化钙（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）、不同含量 PLP（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/L），研究其对GABA产量的影响。

1.2.2.2 发酵培养基组成的优化

选择谷氨酸钠、氯化钙、PLP三个因素，在单因素试验基础上进行L9(34)正交试验，以GABA产量为评价指标，确定发酵培养基的最优组成。正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment单位：g/L

1.2.3 HPLC法测定GABA

1.2.3.1 色谱条件[14]

ZORBAXEclipsePlusC18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流速 1 mL/min；柱温度：40 ℃；进样体积：20 μL；采用二极管阵列紫外检测器PDA-3000，检测波长：265 nm；流动相：A为50 mmol/L乙酸钠溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氢呋喃（82∶8.5∶8.5∶1，V/V），B为50 mmol/L乙酸钠溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氢呋喃（22∶38.5∶38.5∶1，V/V），A-B 为体积比 30∶70 等度洗脱。

1.2.3.2 衍生程序

取80 μL标准溶液或样品于1.5 mL离心管中，依次加入 180 μL 超纯水、160 μL 0.1mol/L 硼酸-硼砂缓冲液（pH 8.6）、240 μL 乙腈和 160 μL 4mmol/L FMOC-Cl溶液，混合均匀，在40℃水浴锅中反应5 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。其中衍生试剂4 mmol/L FMOC-Cl溶液配制方法为：称量0.026 g FMOC-Cl溶于25 mL乙腈中。

1.2.4 数据处理

数据统计与处理采用Origin 8.6和SPSS 22.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC测定香菇柄发酵液中GABA的分析

以FMOC-Cl为柱前衍生剂，采用高效液相色谱法对发酵液中的GABA进行检测。图1~3分别表示标准品、衍生剂、香菇柄发酵液色谱图。通过对比可以看出，GABA与衍生剂色谱图峰形好，得到了很好地分离，GABA出峰的保留时间是5.93 min左右，香菇柄发酵液中其他氨基酸或干扰物对GABA的测定均无影响，说明本法检测GABA能够满足试验分析要求。取不同浓度的标准液，衍生后测定GABA，以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，建立标准曲线，拟合得到回归方程为：Y=0.380 5X+0.414 5（R2=0.999 4），GABA浓度在10~1 000 mg/L时线性关系良好，能用于发酵液中GABA的定量分析。

2.2 发酵培养基成分的确定

2.2.1 谷氨酸钠添加量对发酵液GABA产量的影响

在发酵过程中，谷氨酸钠是谷氨酸脱羧酶催化酶促反应生成GABA的底物，发酵时谷氨酸钠的添加量会直接影响GABA的产量[15]。如图4所示，在基础培养基中添加谷氨酸钠能显著提高GABA产量（P＜0.05），随着谷氨酸钠添加量的增加，GABA产量逐渐增大，当谷氨酸钠添加量达到8 g/L时，GABA产量达到最大，之后继续增加谷氨酸钠添加量，GABA产量反而减小。说明试验菌种利用底物谷氨酸钠进行生物转化GABA的能力是有限的，过量添加反而不利于GABA的积累，这可能是因为底物浓度过高会增强细胞膜的渗透压力，抑制菌体生长，从而导致GABA产量减少[16]。

2.2.2 氯化钙添加量对发酵液GABA产量的影响

谷氨酸脱羧酶是生物技术富集生产GABA的关键酶，有许多资料报道钙离子对谷氨酸脱羧酶有促进作用[17-19]。本试验在其他发酵条件一致的情况下，向基础培养基中添加了不同含量的氯化钙。试验发现（图5）：当氯化钙添加量低于0.2 g/L时，发酵液中GABA产量逐渐增加；氯化钙添加量为0.2 g/L时，GABA产量最高，与添加量为0.3 g/L之间无显著性差异；继续提高添加量，GABA产量显著降低（P＜0.05）。这说明一定范围内添加氯化钙能明显提高发酵液中GABA产量，添加量过高时会因抑制谷氨酸脱羧酶的活性反而使GABA产量降低，这与同仲彬等[20]和Guo等[21]的研究结果一致。

2.2.3 PLP添加量对发酵液GABA产量的影响

PLP是多种脱羧酶的辅酶，能增强脱羧酶活性，促进酶促反应，其添加量会直接影响谷氨酸脱羧酶的活性，进而影响GABA产量[22-23]。由图6可知，培养基中添加PLP后，发酵液中GABA产量呈现先升高再降低后趋于平缓的趋势；PLP添加量小于0.2 g/L时，GABA产量随PLP的增加而显著增加（P＜0.05），添加量达到0.2 g/L时，GABA产量最高，为130.50 mg/L。说明PLP对试验菌种的谷氨酸脱羧酶具有一定的促进作用，谷氨酸脱羧酶活性增强，利于GABA的生成。同时，由于PLP也是GABA-转氨酶的辅酶，当其浓度足够高时，就会促进催化GABA降解成琥珀酸半醛，使GABA产量降低[24-25]。

2.3 发酵培养基组成的优化

根据单因素试验结果，对谷氨酸钠、氯化钙、PLP添加量进行四因素三水平正交试验，试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

根据表2的结果，经极差分析可知，3个因素对GABA产量的影响从大到小的顺序为：A＞C＞B，即谷氨酸钠添加量影响最大，其次是PLP添加量，氯化钙添加量的影响最小。发酵培养基组成的最优组合为A2B3C2，即谷氨酸钠添加量为8 g/L，氯化钙添加量为0.3 g/L，PLP添加量为0.2 g/L。经验证试验得出，该最优组合的GABA产量为190.93 mg/L。由表3方差分析可知，谷氨酸钠添加量（A）和PLP添加量（C）对GABA产量影响显著（P＜0.05），而氯化钙添加量（B）对GABA产量的影响相对较小。

2.4 香菇柄发酵前后GABA含量的比较

香菇柄发酵前后GABA含量的HPLC分析结果见图7。

对比香菇柄发酵前后GABA含量的离子色谱图，根据面积归一化法计算出发酵前后GABA的含量，结果见表4。经过发酵后，发酵液中GABA产量由31.82 mg/L提高至190.93 mg/L，未经过发酵处理的香菇柄中GABA含量是0.493 mg/g菇粉，采用优化后发酵工艺进行发酵后的香菇柄中GABA含量增加到2.959 mg/g菇粉，比香菇柄原料提高了5倍，说明利用乳酸菌发酵香菇柄可以富集GABA。

表4 香菇柄发酵前后GABA含量的比较Table 4 Comparison of GABA content in Lentinus edodes stem before or after fermentation

3 结论

本研究采用FMOC-Cl衍生HPLC法定量分析GABA，通过单因素试验和正交试验对乳酸菌发酵香菇柄的培养基成分进行优化，确定了最佳发酵培养基成分为：谷氨酸钠添加量8 g/L，氯化钙添加量0.3 g/L，PLP添加量0.2 g/L。在此条件下，发酵液中GABA产量可达190.93 mg/L，发酵香菇柄中GABA含量达到2.959 mg/g菇粉，比未经发酵处理的香菇柄原料提高了5倍。发酵菌种、发酵原料对GABA含量具有很大的影响。本文研究结果表明，基于乳酸菌进行富含GABA和乳酸菌功能性香菇柄食品的研究和开发是可行的，是拓展香菇柄的精深加工、增强其功能性的一条新途径，但试验菌种产GABA的代谢途径及发酵后香菇柄的抗菌功能还有待于进一步的研究。