传统山西老陈醋增香酵母菌的筛选及其特性研究

陈 嘉，冯志宏，施俊凤

（山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所，山西 太原 030031）

山西老陈醋以“蒸、酵、熏、淋、陈”五步工艺传承至今[1]，是我国国家地理标志性产品，具有鲜明的地方特色。传统食醋发酵过程主要分为酒化和醋化阶段，食醋的风味物质大部分是在酒化过程中形成带入产品的[2-3]，这些风味物质主要通过大曲中的菌系、酶系产生[4]。酒化中酯类和醇类物质主要由酵母代谢合成[5]。酒化阶段主要的酵母菌有酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母等[6]。在传统山西老陈醋酿造过程中，微生物的生长受到各种因素的影响[7]，如菌种组成、发酵温度、酒度、酸度等，它们直接影响产品的风味[8]、色泽[9]、品质。我国传统发酵制品中广泛存在着优良的自然菌株，可作为分离筛选优良野生菌株的重要来源[10]。根据传统酿造食品生产的需求，针对不同产品发酵特点进行优良菌种的选育并建立相适应的发酵技术规范，对于促进我国传统酿造调味食品现代化，提高产品市场竞争力具有重要的意义。

本试验从传统山西老陈醋中分离纯化酵母菌菌株，通过26S rDNA测序鉴定。采用顶空固相微萃取（HS-SPME）法结合气-质联用技术（GC-MS）对分离得到的酵母菌发酵液中的主要挥发性成分进行分析[11]，筛选出产醇香或酯香的酵母菌菌株，对其耐酸性、乙醇耐受性和高温耐受性进行研究，旨在为山西老陈醋用酵母菌菌株的研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

醋醅样品：于2017年12月采集自山西紫林醋业有限公司山西老陈醋传统工艺生产车间。

酵母基因组DNA提取试剂盒、2×Es Taq Master Mix（含染料），购自北京康为世纪生物科技有限公司；孟加拉红选择培养基、麦芽汁培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培养基，购自海博生物技术有限公司；安琪活性干酵母，购自安琪酵母（伊犁）有限公司；乙醇、NaCl、乙酸，购自国药集团化学试剂有限公司；美蓝试剂，购自上海经科化学科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

MLS-3020型全自动高压灭菌器，T100TMThermal Cycler PCR仪，Centrifuge 5415R高速冷冻离心机，ZHWY-103B型恒温培养振荡器，SPX-100B-Z型生化培养箱，OLYMPUS CX21型显微镜，BS224S型电子天平，自动SPME进样器，DB-Wax型毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），TRACE-ISQ 气相色谱-质谱联用仪，20 mL进样瓶，65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯（PDMS/DVB）纤维萃取头。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分离纯化

准确称取10 g醋醅样品置于90 mL生理盐水中，28 ℃振荡培养 30 min，依次稀释至 10-5、10-6，取100 μL稀释液涂布于孟加拉红培养基，28℃培养48 h。挑取具有典型酵母菌落特征的单菌落，划线分离纯化[12]。将具有酵母细胞特征的菌株转入YEPD斜面培养基，4℃保存，备用。酵母菌活化后接种到YEPD琼脂培养基上，28℃恒温培养48 h，观察菌落形态；载玻片上滴加1滴0.05%美蓝试剂与少量菌体混匀，加盖玻片，显微镜下观察细胞形态。

1.2.2 菌株26S rDNA分子鉴定

根据酵母基因组DNA提取试剂盒操作说明提取酵母基因组DNA，核酸蛋白测定仪ND-1000测定DNA纯度、浓度，-80℃保存[13]。参考GenBank上已登录的代表菌株26S rDNA近5’端的D1/D2区域序列（登录号：KC442921.1），设计1对特异性引物，引物序列为（5’-3’）：NL-1(GCATATCAATAAGC GGAGGAAAAG)和NL-4(GGTCCGTGT TTCAAGACGG)。以不同酵母基因组DNA为模板，构建15 μL PCR反应体系[14]：正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.6 μL，基因组 DNA 模板0.8 μL，ddH2O 5.5 μL，2 × Es Taq Master Mix 7.5 μL。反应条件：94℃3 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35个循环；72℃5 min，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，交由北京华大中生科技发展有限公司测序，测序结果进行Blast比对。

1.2.3 发酵液中挥发性风味物质的测定

接一环斜面菌种于5 mL麦芽汁液体培养基中，30℃振荡培养1 d，按20%（V/V）接种于山西老陈醋物料中，发酵酿醋，澄清过滤，4℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清液，4℃保存备用。吸取8 mL上清液置于20 mL的分析瓶中，加入0.6 g NaCl加盖封口。采用顶空自动进样法[15]：①顶空进样器条件：振荡温度45℃，振荡时间2 min，进样量2 mL。②气相色谱（GC）分析条件：色谱柱为 TR-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度 300℃，载气 He，流速 1 mL/min；进样量 350 μL，分流比为 20∶1；升温程序：起始温度40℃，保持3 min，以3℃/min的速度升温至190℃，保持5 min，以20℃/min的速度升温至270℃，保持5 min；③质谱（MS）条件：电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV，离子源温度250℃，传输线温度280℃，四极杆温度180℃，质量扫描范围（m/z）：35~500。

1.2.4 酵母菌耐酸性

将活化后的酵母菌悬液按3%的接种量接种于pH 分别为 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的 YEPD 液体培养基中，28℃振荡培养72 h，将培养液4 000 r/min离心10 min，弃上清，称量菌体湿重。

1.2.5 酵母菌的乙醇耐受性

将活化后的酵母菌悬液按3%的接种量接种于乙醇浓度分别为6%、8%、10%、12%的YEPD液体培养基中，28℃摇床培养72 h，将培养液4 000 r/min离心10 min，弃上清，称量菌体湿重。

1.2.6 酵母菌高温耐受性

按3%的接种量接种活化后的酵母菌于YEPD液体培养基中，分别置于 30、35、40、45、50 ℃条件下培养72 h，将培养液4 000 r/min离心10 min，弃上清，称量菌体湿重[16]。

1.2.7 数据处理

采用SPSS Statistics 24软件分析数据并作图。

2 结果与分析

2.1 酵母菌菌株的筛选与鉴定

从传统山西老陈醋的发酵过程中进行酵母菌菌株的筛选。通过菌种形态观察以及利用显微镜观察其细胞形态和菌丝形态，初步获得了5株菌株，有待进一步鉴定。

提取该5株菌株的基因组DNA进行PCR扩增，以市售安琪活性干酵母为对照（CK），扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

由图1可见，共扩增出6条特异条带。回收扩增产物，测序，Blast序列同源性比对，结果见表1。Blast结果显示，菌株Y1为酿酒酵母，Y26为毕赤酵母，Y30为假丝酵母，Y68为红酵母，Y70为盔形毕赤酵母。

表1 不同菌株26S rDNA鉴定结果Table 1 Identification of different strains by 26S rDNA

2.2 增香酵母发酵液挥发性风味成分分析

传统山西老陈醋发酵工艺中，微生物发酵产生挥发性成分，风味物质主要为醇类和酯类。利用HS-SPME-GC-MS法分析6种酵母菌发酵液中的挥发性成分，空白组为不添加酵母发酵液，结果见表2。由表2可知，不同酵母菌发酵液中，挥发性成分种类和数量之间差异较大。Y1发酵液中醇类挥发性物质相对峰面积最大，为52.31%，占其总挥发性物质一半以上。6种发酵液中均有酯类挥发性物质产生，且Y1、Y26、Y30、Y68 和 Y70 发酵液中挥发性酯类峰面积均比对照组中多；Y70发酵液中酯类物质相对峰面积最大，为37.76%，其中乙酯类为30%，占总酯类物质79.45%。Y26和Y70发酵液中均有己酸异戊酯和乳酸乙酯产生；其中乳酸乙酯带有发酵香气，是构成山西老陈醋香气的重要组成成分。

2.3 增香酵母的发酵特性试验

2.3.1 耐酸性

传统山西老陈醋发酵工艺又称为“三边”发酵，即边糖化、边酒化、边醋化。整个发酵进程中，酵母菌通常与醋酸菌、乳酸菌同时作用，因此酵母菌必须适应产酸菌造成的酸性环境并能良好生长。发酵过程中，有机酸不断形成和累积，pH范围为3.6~3.9。适宜于

山西老陈醋的酵母菌必须有良好的耐酸性，一般要求能耐受pH 3～3.5。由图2可以看出，Y30和Y26在pH 3～3.5发酵液中生长良好，具有一定耐酸性。

表2 发酵液中醇类、酯类成分的GC-MS 分析结果Table 2 Determination of alcohols and esters in fermentation broth by GC-MS

2.3.2 乙醇耐受性

传统山西老陈醋固态发酵过程中，随着发酵液中乙醇浓度的增加，酵母菌受到的乙醇胁迫越来越大。山西老陈醋发酵过程中乙醇最高浓度达10%，高浓度乙醇影响酵母菌的生长和发酵能力，进而限制产物浓度的提高，因此所用酵母应具有较好的乙醇耐受性，一般要求菌种至少能耐受10%的乙醇。由图3可以看出，Y26在10%乙醇发酵液中生长良好，具有较好的乙醇耐受性。

2.3.3 高温耐受性

传统山西老陈醋固态发酵过程中，酵母菌与醋酸菌共存并同时代谢，醋酸菌有氧呼吸释放大量的热，导致物料温度最高上升到42～45℃。传统酵母发酵最适温度为28～33℃，温度变化导致微生物生长和繁殖速度改变以及微生物酶活性的变化，进而影响产品品质和产量。因此酵母菌须适应高温环境并良好生长。由图4可以看出，随着发酵液温度的升高，菌株生长均受到抑制，各菌株间差异不显著。

3 结论

从传统山西老陈醋中分离筛选得到5株酵母菌，经鉴定Y1为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），Y26为毕赤酵母（Pichia scaptomyzae），Y30为假丝酵母（Candida humilis），Y68 为红酵母（Rhodotorula sp.），Y70为盔形毕赤酵母（Pichia membranifaciens）。经固相微萃取和气质联用技术分析这5株酵母菌发酵液的主要挥发性醇类和酯类物质发现，挥发性成分种类和数量之间差异较大，其中酿酒酵母Y1发酵液中醇类挥发性成分最多，但种类少于毕赤酵母Y26和红酵母Y68。这5株酵母菌醇类挥发性物质中，均含有乙醇、苯乙醇、2-乙基己醇和糠醇，它们具有强烈的香味。毕赤酵母Y26和盔形毕赤酵母Y70发酵液中酯类挥发性成分含量较高，对风味的贡献相对较大，醋酸乙酯含量较高。

5株酵母菌发酵特性研究结果表明，假丝酵母Y30具有优良的耐酸性，在pH 3～3.5时仍生长良好，推测是1株嗜酸酵母菌；毕赤酵母Y26具有优良的乙醇耐受性，且具有高产乙酯类、低产高级醇的特性。综合比较，毕赤酵母Y26有望开发为山西老陈醋的新型发酵剂。