不同氧环境对GI698菌株生长特性影响

王永胜 张洪钦 汤晓龙

作者单位：1 复旦大学附属中山医院厦门医院药剂科，福建 厦门 361015；2 厦门大学附属福州第二医院药剂科，福建 福州 350007；3 厦门万泰沧海生物技术有限公司研发部，福建 厦门 361022

利用基因工程技术生产HPV疫苗是目前国内外研究的热点之一。目前国际上市的HPV疫苗采用真核表达系统，由于表达量低，培养成本高，大规模工业化生产困难，使得产品成本高昂，限制了其在发展中国家的应用[1-2]。近年来国内该疫苗研发多采用大肠杆菌原核表达系统，因其是目前人类掌握最成熟、应用最广的表达系统。大肠杆菌因其培养要求低、遗传背景清楚、表达量高及安全、成本低等优点成为生命科学研究模式生物之一。基因工程菌发酵可获得大量外源基因表达产物[3]，建立稳定高效的高密度发酵工艺是实现产业化生产关键。本研究拟使用GI698菌株考察大肠杆菌在不同氧环境下生长特性，观察其在LB培养基中生长规律，寻找有利于疫苗株生长培养方式，为疫苗大规模生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

医用型洁净工作台 （江苏苏净集团有限公司，型号：SWCJ-1FD，批号：109659GC5186）；紫外可见分光光度计（日本岛津，型号：UV-2450，批号：206-86430-93）；水浴恒温振荡器（常州市仪都仪器有限公司，型号：SHZ-82A，批号：无）。其余物料、耗材见表1。

表1 主要物料、耗材

1.2 菌种

大肠杆菌GI698菌株为实验用标准阳性菌株。

1.3 培养基

按表2配制Luria-Bertan（LB）培养基，三个摇瓶在工作过程，培养基中含氧量顺序为：带挡板可呼吸摇瓶＞带档板不可呼吸、普通摇瓶。

1.4 方法

发酵方法：按表2配制LB培养基，分装至3瓶1 L的三角瓶进行发酵实验，装液量为500 mL并高温灭菌。冻存管保藏的大肠杆菌工作种子常温解冻后，取5 mL初始葡萄糖分别加入三瓶摇瓶培养基中，每瓶接种750 μL工作种子。两个带挡板三角烧瓶分别用带滤膜瓶盖和密封瓶盖。三者置于30℃恒温震荡摇床培养。

检测方法：间隔一定时间，取样并稀释至一定倍数（测定样品的OD600值0.3～0.8之间），分光光度计测定吸光值。

2 结果

在发酵前5 h，三种摇瓶生长情况一致，处于生长迟缓期。6 h后，均进入对数期，两个带挡板烧瓶菌液OD值高于普通三角烧瓶。其中带挡板可呼吸烧瓶菌液生长情况最好，培养24 h后，其OD值比普通三角烧瓶、带挡板密封烧瓶，分别要高出36.36%，16.00%。结果见表3。

三种培养模式过程中，前5 h菌体OD值变化不大，菌体细胞处于生长迟缓期；6 h后生长较快几乎呈倍数生长，表明菌体进入生长对数期；9 h后生长放缓，可能由于营养物质耗尽以及有害代谢物质（如乙酸）积累，影响生长。经过几个小时停滞期后，菌体再次开始二次生长。（结果见图1）。

3 讨论

一般大肠杆菌生长过程需要氧气参与，溶解氧浓度对菌体生长和产物形成影响较大，尤其在高密度发酵中期菌体呈指数扩增。随着菌体生长，菌体密度升高，溶氧下降，生长减慢，在发酵后期菌体耗氧极大，如果供氧不足就会导致表达量下降。对于不同菌株和不同表达产物需控制的溶氧值也不同，溶氧过高，会产生氧化物基、羟自由基等有害物质引起氧中毒现象，从而影响生长、表达。溶氧浓度过低会弱化TCA循环[4]，改变转录水平相关基因与葡萄糖和乙酸代谢，导致乙酸大量积累[5-6]。在发酵过程中要保证溶氧大于临界氧浓度，可避免菌体因供氧不足或过量带来的伤害。已有研究认为在摇瓶中取样时间超过2 min会造成缺氧，从而产生生长抑制，因而对摇瓶培养工艺研究应特别注意因取样发生的溶氧限制问题[7]。控制溶氧主要是通过搅拌速度和通气量实现，发酵前期，增大搅拌速度和通气量使溶氧增加，发酵后期细胞浓度较高时，可通入纯氧满足对氧气需求[8]。而这些因素又直接影响外源蛋白产量高低。本研究中随着菌体进入生长对数期，可呼吸烧瓶OD值比普通三角烧瓶、带挡板密封烧瓶值要高出36.36%、16.00%。结果表明该菌株在耗氧情况下比厌氧情况下生长更好。

表2 LB培养基配置表

表3 OD600检测数据

图1 不同培养模式菌体生长曲线

由于表达系统、表达外源基因不同，工程菌发酵模式是不固定的，但发酵过程中都必须考虑培养基组成[9]。根据组成成分，培养基可分为合成培养基、半合成培养基和复合培养基。目前大肠杆菌高密度发酵常用培养基为半合成培养基，其各组分的浓度和比例要适当，过量营养物会抑制细菌生长，尤其是碳源和氨源的比例[10-11]。在大肠杆菌高密度发酵中，通常需投入几倍于生物量培养基质，才能充分满足高密度生长及大量表达目标蛋白需要。单纯靠增加培养基质并无法实现高密度发酵[12-13]。本研究中菌体生长迟缓期OD值变化均不大，经历了生长对数期，随后生长放缓，可能由于营养物质耗尽以及有害代谢物质（如乙酸）积累，影响菌体生长。经几个小时停滞期后，菌体再次开始生长，可能由于菌体细胞利用乙酸作为碳源，进行二次生长。结果提示大肠杆菌GI698菌株在LB培养基中可进行第二次生长。

综上所述，本研究初步明确了大肠杆菌GI698菌株菌体在较高氧含量环境地带挡板可呼吸摇瓶中能更好地生长。大肠杆菌GI698菌株在LB培养基中能进行第二次生长。通过对工程菌发酵培养条件方式不断研究改进，科学控制发酵环节，有望实现目标产物规模化生产。