MCP-1、VEGF 在人脑胶质瘤中的表达及其相关性

王宏宇，韦 焘，王进昆，杨智勇，王伟民，丁 鹏

（1）吉林省神经精神病医院神经外科，吉林四平 136000；2）昆明医科大学图书馆，云南昆明 650500；3）昆明医科大学第一附属医院神经外科，云南昆明 650032）

神经胶质瘤起源于上皮细胞，是颅内最常见的原发恶性肿瘤，呈侵袭性生长，具有术后复发快，死亡率高等特点，总体治疗效果不佳，直至目前仍为神经外科最为难治的肿瘤之一[1-2]。分子水平差异的内在肿瘤生物学特性，在胶质瘤治疗中至关重要[3]。MCP-1 即单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1）是具有趋化、活化单核巨噬细胞的一类趋化因子，属趋化因子CC 类家族，是其家族中最先被克隆的趋化因子，近年通过对MCP-1 深入研究、对其结构、功能已有新的认识[4]发现其在多种疾病的发生和发展过程中作用关键。VEGF 即血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial cell growth factor），是一类血小板源性蛋白[5]，以旁分泌方式作用于血管内皮细胞，促进其增殖并诱导血管生成，并被认为是已知的最强烈的刺激血管形成的物质。在多种恶性肿瘤细胞中均发现其大量表达，在肿瘤中呈高表达的VEGF能与其相应的受体特异性结合，继而诱发肿瘤血管新生；而持续、广泛的新生血管可提供养分给肿瘤细胞。胶质瘤的发生发展是一个非常复杂的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，受到许多细胞因子的调控。笔者通过免疫组化的方法在对人脑胶质瘤中MCP-1 与VEGF 的表达水平与病理学分级关系上进行实验，分析两者表达与病理级别的关系，探讨其是否具有协同作用。

1 材料与方法

1.1 标本及分类

选取适合本研究的胶质瘤术后病理存档蜡块共44 例，Ⅰ-Ⅳ级各11 例。其分类及分级诊断标准照1993 年WHO 的标准[6]，并再次经病理证实。均排除合并其它器官肿瘤、伴风湿免疫系统疾病的患者。

1.2 主要试剂

MCP-1 和VEGF 单克隆抗体、链酶亲和素-生物素-过氧化物酶附合物免疫组化试剂盒和DAB 显色试剂盒分别购于北京博奥森生物技术有限公司、北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

免疫组化染色：采用免疫组化法，操作步骤严格按照说明书标准。MCP-1 抗体的工作浓度为1：60；VEGF 为即用型试剂，PBS 代替一抗作阴性对照。

1.4 阳性结果判定

阳性反应判断由2 位病理主治医师共同阅片得出。MCP-1 主要表达在细胞膜和细胞浆中，细胞核中无表达；VEGF 主要位于细胞膜上，细胞浆中也有表达，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，无棕黄色反应颗粒。随机选择高倍镜（HP:X400）下5个视野，合并计算阳性百分比。镜下平均每个视野的细胞膜（浆）呈阳性反应的细胞数≥10%为阳性，无阳性反应或阳性反应细胞数＜10%为阴性。

1.5 图像分析

实验所得图片采用专业图像分析软件Image-ProPlus6.0 分析处理，免疫反应的标记强度均用矫正IOD 值（CIOD 值）。

1.6 统计学处理

实验数据分析应用SPSS 软件完成。统计分析应用卡方检验及Spearman 相关分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCP-1 与VEGF 在各病理级别胶质瘤中的表达

MCP-1 与VEGF 的表达率在病理级别高的标本中高于病理级别低的标本，见图1、图2。

2.2 MCP-1 与VEGF 在各病理级别胶质瘤中的统计学分析

MCP-1 与VEGF 在病理Ⅲ～Ⅳ级中的表达高于Ⅰ-Ⅱ级（P ＜0.05），见表1。

2.3 MCP-1 与VEGF 在胶质瘤中表达的相关性

MCP-1 与VEGF 在胶质瘤中的表达，前者CIOD 值的中位数和上下四分位数为19.50[6.00,33.00]，后者CIOD 值为13.50[5.25,24.50]。经过Spearman 相关分析，两者呈正相关，r=0.734，P=0.001，P ＜0.05。

3 讨论

新生血管是实体肿瘤生长的必要条件。血管生成是不同生长因子程序化调控的复杂过程[6]。VEGF是血管新生的关键因子之一[7]。并被认为其在已知的刺激血管形成的物质中最为强烈。VEGF 首先从瘤细胞的分泌物中分离出，并通过旁分泌形式作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖并诱导血管生成。在全身多系统的恶性肿瘤细胞中均有发现VEGF 大量表达，大量表达的VEGF 在与相应的受体特异性结合后，促进肿瘤血管生成；已有研究证实胶质瘤最常见的侵袭途径是沿血管基底膜侵袭，由VEGF 介导、增加血管通透性进一步促进了胶质瘤的侵袭和转移。间接证明了在胶质瘤血管新生、促进肿瘤细胞恶性增殖中均有VEGF 的参与并为肿瘤的侵袭及转移提供条件[8-9]。本实验结果也证实在人脑胶质瘤中VEGF 大量表达，且表达阳性率随病理级别的增高而表达增强。

图1 MCP-1 在Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤中的表达（SP 法×100）Fig.1 Expression of MCP-1 in glioma Ⅰ-Ⅳ（IHC:SP×100）

图2 VEGF 在Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤中的表达（SP 法×100）Fig.2 Expression of VEGF in glioma Ⅰ-Ⅳ（IHC:SP×100）

表1 MCP-1 与VEGF 在各级胶质瘤中的表达水平［n（%）］Tab.1 MCP-1 and VEGF expression in gliomas with all grades ［n（%）］

随着对MCP-1 结构、功能的不断研究，发现其在口腔癌[10]、鼻咽癌[11]、胃癌[12]、结直肠癌[13]、肺癌[14]等研究中与肿瘤的恶性程度、生长、转移等方面密切相关。笔者的实验结果与大多数恶性肿瘤一致，胶质瘤的病理级别越高，MCP-1 表达越丰富。

在人脑胶质瘤中联合检测MCP-1 与VEGF 的相关性研究目前较少见诸报到。本实验联合检测在人脑胶质瘤中MCP-1、VEGF 的表达水平并得出两者之间存在着正相协同关系结论，即MCP-1 与VEGF 在人脑胶质瘤中的表达均随病理级别增高而表达增强。

有学者研究表明肿瘤相关巨噬细胞（tumor-association macrophages，TAMs）通 过 分 泌VEGF 等多种促血管生成因子促进血管的新生[15]。在胶质瘤中，MCP-1 趋化巨噬细胞进入肿瘤组织中将其诱导分化为肿瘤相关巨噬细胞，并被认为是巨噬细胞趋化募集的强烈趋化因子。通过肿瘤相关巨噬细胞间接促进肿瘤血管的生成[16-17]也已经被大量研究所证实。Koga 等[18]研究指出抑制MCP-1 作用，可抑制TAMs 募集，间接阻滞黑色素瘤血管生成和肿瘤生长。这些研究说明MCP-1 可通过抑制TAMs 趋化募集间接抑制肿瘤血管生成。Futagami等[19]发现MCP-1 通过上调环氧化酶-2 而促进VEGF 的生成。所以MCP-1 能在多种机制中通过间接途径促进VEGF 的生成而诱导肿瘤组织的大量血管新生；抑制MCP-1/CCR2 轴能间接抑制肿瘤的增殖也被许多实验研究所证实。本研究联合检测MCP-1、VEGF 蛋白的表达量并分析得出两者之间存在着正相协同关系是对MCP-1/CCR2 轴能间接促进VEGF 生成即血管新生的很好印证，这也为本课题继续深入研究MCP-1/CCR2 轴是否存在其它间接促进VEGF 生成的机制或直接机制提供后续研究可能。