三种不同饮食干预建立非酒精性脂肪肝模型

张 丹，吕俊衍，邓 溢，周 波，耿坐涛，罗粟风，王金香，文 玉，应昀晏，文代艳，马岚青

（1）昆明医科大学第一附属医院消化内科，云南昆明 650032；2）昆明医科大学临床医学专业，云南昆明 650500；3）丽江市儿童医院普外科，云南丽江 530721）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是除外酒精和其他明确的损肝因素所致的脂肪在肝脏堆积所产生的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪性变为主要病变的临床病理综合征[1]，有报道表明NAFLD 在人群中的患病率为20%～40%[2-3]。并且2018 年指南指出：NAFLD 已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生物化学指标异常的首要原因[4]。

目前国内外常用的NAFLD 动物模型有：（1）营养失调性模型，包括高糖、高脂[5]、胆碱缺乏等诱发模型[6-7]；（2）药物中毒模型，包括CCl4[8]、四环素、乙硫氨酸诱发模型；（3）基因改良模型，有ob/ob 小鼠[9]、FLS 小鼠、PNPLA3 转基因小鼠、ArKO 小鼠模型；（4）基因饮食复合性模型，有研究用ob/ob 小鼠+MCD 饮食建立龋齿动物NAFLD模型[10]；（5）中医病症结合模型[11]。NAFLD 动物模型研究不断取得新进展，但病因机制复杂，尚不能完全阐述其相关的机制，从目前研究看，复合模型在模拟人类NAFLD 的发生发展发挥重要作用，但建模组合繁多，缺乏统一标准。由于中医模型的特殊性，在推广和认可上存在一定难度。

因此本文利用3 种不同饮食干预建立NAFLD模型，并进行了对比，旨在为不同病因引起的NAFLD 的发病机制及分子基础研究提供理想而可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6 小鼠60 只，日龄42 d，体质量20～23 g，由南京大学-南京生物医药研究院提供，SPF 级环境饲养。许可证号:SCXK（苏）2015-0001，恒温（20±2）℃及湿度（50±5）%条件，人工照明明暗各12 h，自由进食水，适应1 周后随机分组。小鼠组织取材在昆明医科大学动物实验中心屏障设施内完成，本研究符合昆明医科大学实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。

1.1.2 主要仪器与试剂 酶标仪（Thermo Scientific）；血糖仪（三诺生物传感股份有限公司，GA-3型）；小鼠胰岛素（INS）酶联免疫吸附测定试剂盒（Elabscience 产品货号：E-EL-M2614c）；甘油三酯（TG）测定试剂盒（Elabscience 产品货号：E-BC-K238）；油红染色试剂盒（Solarbio 产品货号：G1261）。

1.1.3 饲料 3 种不同饲料均购自北京博泰宏达生物技术有限公司，高脂饲料自制（总热量为25.07 kj/g，其热比为蛋白质20%、碳水化合物20%、脂肪60%）；叶酸缺乏饲料自制（普通饲料去除叶酸）；高蛋氨酸饲料自制（普通饲料基础上加2%蛋氨酸）；普通饲料购自昆明医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养方法 将60 只C57BL/6 小鼠随机分成4 组，每组15 只，N 组只给予普通饲料；HFD 组只给予高脂饲料；FD 组只给予叶酸缺乏饲料；HCY 组只给予高蛋氨酸饲料，饲料量为每只小鼠（5±1）g/d，饮用高温灭菌水，不限量。每天观察食水消耗情况，每周称体重并做详细记录。饲养11 周或14 周后禁食12 h 后，进行下述各项实验。

1.2.2 空腹血糖及血清胰岛素检测 干预饮食14周后，腹腔注射3%戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉后进行心脏取血，测小鼠空腹血糖，取全血样品于室温放置2 h 后1 000×g 离心20 min，取上清，利用ELISA 试剂盒检测血清中胰岛素含量，最后计算出各组胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）及胰岛素敏感指数（HOMA-ISI）。计算公式：胰岛素抵抗指数=（空腹血糖（mmol/L）×血清胰岛素（mIU/L））/22.5；胰岛素敏感指数=1/（空腹血糖（mmol/L）×血清胰岛素（mIU/L））。

1.2.3 肝指数的计算 迅速取肝脏，称重记录，计算肝指数（肝指数的计算方式：肝指数＝肝湿重／体质量×100%）。

1.2.4 肝组织甘油三酯检测 精确称量组织重量，根据重量（g）:体积（mL）=1:9 的比例加入匀浆培养基，在冰水浴中机械匀浆肝组织。以620×g离心10 min，然后取上清液利用GPO-PAP 方法测定肝组织中甘油三酯（TG）含量。

1.2.5 肝组织病理检测 用10%中性甲醛溶液固定肝脏组织，脱水、包埋、4℃保存，进行常规HE 染色；取新鲜肝组织做冰冻切片，利用油红O试剂盒染色，光镜下观察大鼠肝脏脂肪变性情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS 统计软件处理资料。计量资料用W检验进行正态性检验，实验结果数据以（）表示，均数多组间比较采用方差分析，以LSD－t 进行组间差异的两两比较，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的一般状况、体重体型比较

实验过程中各组小鼠状态均良好，食欲佳，性情较为温顺，活动正常。各组小鼠饮水和尿量无明显差异，HFD 小鼠粪便颜色偏浅黄，HCY 组小鼠排泄物异味较重。各模型组较N 组干预饮食后1周体重差异无统计学意义（P ＞0.05）；干预饮食14 周后HFD 组较N 组体重明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.0001），HCY 组较N 组体重明显减轻，差异有统计学意义（P ＜0.05），FD 组较N 组体重差异无统计学意义（P ＞0.05），见图1。干预饮食14 周后，随机选取小鼠测量臀部最宽处，HFD 小鼠较其他各组较宽，见图2。

图1 正常对照组与模型组体重变化趋势Fig.1 Weight change trend in normal control group and model groups

图2 正常对照组与模型组体型对比Fig.2 Comparison of body size between the normal control group and the model groups

2.2 小鼠肝湿重及肝指数比较

干预饮食14 周后，取出肝脏，记录肝湿重，计算肝指数。与N 组比较，FD 组及HCY 组小鼠肝湿重均降低（P ＜0.001 或P ＜0.05）；与N 组比较，HFD 组及FD 组肝指数显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠肝湿重及肝指数变化的比较（）Tab.1 Comparison of liver wet weight and liver index of mice in each group（）

表1 各组小鼠肝湿重及肝指数变化的比较（）Tab.1 Comparison of liver wet weight and liver index of mice in each group（）

与N 组比较，***P ＜0.01，****P ＜0.0001。

2.3 小鼠肝脏大体形态观察及肝组织病理观察

2.3.1 肝脏大体形态观察 干预饮食14 周后，观察肝脏大体情况，N 组肝表面颜色普遍黯红，色泽鲜亮，边缘锐利，无油腻感；模型组肝脏稍黄，切面有油腻感，见图3。

图3 正常对照组与模型组肝脏大体形态对比Fig.3 Comparison of liver gross morphology between the normal control group and the model groups

2.3.2 肝脏HE 染色结果 光学显微镜下观察肝脏组织HE 染色病理切片，N 组肝组织结构完整清晰、肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀，无脂肪变性；HFD 组、FD 组、HCY 组均出现脂肪变性，可见肝细胞肿大变圆，胞浆疏松，呈弥散性肝细胞空泡变性，且在干预饮食14 周后的脂肪变性较11 周更明显，出现大量的脂肪变性空泡，模型组中HFD 组脂肪变性最为严重，呈大泡型，而FD 及HCY 组以小泡型为主，见图4。

2.3.3 肝脏油红O 染色结果 光学显微镜下观察肝脏组织油红O 染色结果，与N 组相比，HFD 组、FD 组及HCY 组的胞浆中均有橘红色脂滴形成，散在分布；且在干预饮食14 周后橘红色脂滴布满全视野，较11 周更明显，且模型组中HFD 组脂肪沉积最为严重，见图5。

图5 正常对照组与模型组肝脏油红O 染色结果（×400）Fig.5 Oil red staining results of liver in the normal control group and the model groups（×400）

2.4 各组小鼠肝组织甘油三酯比较

干预饮食14 周后，HFD、FD 及HCY 组分别与N 组比较肝组织TG 水平显著增高，差异有统计学意义（P ＜0.05），FD 组TG 含量最高，分别与其它模型组相比差异无统计学意义（P ＞0.05），见图6。

2.5 各组小鼠胰岛素抵抗情况比较

干预饮食14 周后，与N 组相比，HFD 组胰岛素抵抗指数显著增高（P ＜0.01），而FD 组及HCY组较N 组差异无统计学意义（P ＞0.05），但呈现增高趋势；HFD 组胰岛素敏感指数显著降低（P ＜0.05），同样的，FD 组及HCY 组较N 组差异无统计学意义（P ＞0.05），但呈现明显降低趋势见表2、图7。

图6 正常对照组与模型组肝组织TG 比较Fig.6 Comparison of hepatic TG between the normal control group and the model groups

图7 正常对照组与模型组胰岛素抵抗指数及敏感指数比较Fig.7 Comparison of insulin resistance index and sensitivity index between the normal control group and the model groups

表2 正常对照组与模型组胰岛素抵抗指数及敏感指数比较（）Tab.2 Comparison of insulin resistance index and sensitivity index between the normal control group and the model groups（）

表2 正常对照组与模型组胰岛素抵抗指数及敏感指数比较（）Tab.2 Comparison of insulin resistance index and sensitivity index between the normal control group and the model groups（）

与N 组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

3 讨论

目前尚未有研究做过3 种模型的横向比较，且对叶酸缺乏及高HCY 导致的NAFLD 研究太少，本研究的价值在于：通过小鼠一般情况监测、肝组织病理学观察及相关生化指标检查证实了3 种不同饮食干预均可成功建立NAFLD 模型的同时，对其进行了横向对比，并结合临床现状得出HFD 偏向于模拟超重且较严重的NAFLD，FD 偏向于模拟体重变化不大伴营养缺乏的NAFLD，而HCY 偏向于模拟体重不增伴高HCY 的NAFLD，提醒研究者们在今后NAFLD 的病因机制研究中的模型设置方面要全面考虑，根据不同的病因建立适合的NAFLD模型。

经典的HFD 模型：雄性大鼠分别摄入71%的脂肪、11%的碳水化合物和18%的蛋白质，该种建模方法的脂肪含量与美国的平均饮食相同，喂养3周后HFD 大鼠出现脂肪变性、IR、线粒体功能障碍[12]。干预16 周后，脂肪变性、肝细胞膨胀、血糖升高、脂联素降低和IR[13]。在笔者的研究中，C57BL/6 雄性小鼠摄入蛋白质20%、碳水化合物20%、脂肪60%，干预14 周后体重明显增加、体型肥胖、IR 显著增高、ISI 降低、TG 显著增高；HE 及油红O 染色均显示脂肪变性，控制HFD 干预时间建立不同程度脂肪肝模型，可模拟临床上轻、重度脂肪肝患者。

叶酸缺乏会导致胆碱流失，甲基化能力受损，进而使甘油三酯在肝脏中堆积，叶酸缺乏还能降低一种通过甲基化合成磷脂酰胆碱的酶[14]，同时，也有研究表明，磷脂酰胆碱是极低密度脂蛋白很重要的组成成分，它能将甘油三脂运输出肝脏[15]，综上研究说明叶酸缺乏可导致脂质沉积，这与笔者病理结果相符。生活中，很少人会主动补充叶酸，很有可能增加NAFLD 的患病风险。且目前叶酸缺乏诱导NAFLD 的研究尚少，本文利用叶酸缺乏建立NAFLD 模型，并与其他病因导致的NAFLD 模型进行对比，为预防和治疗叶酸缺乏相关NAFLD 的研究提供新思路。

HCY 诱导NAFLD 机制复杂，但越来越多研究发现HCY 与NAFLD 的患病率显著相关，建立理想的HCY 模型进一步探讨NAFLD 机制显得尤为重要。有研究选用雄性C57BL/6J 给予高蛋氨酸饮食，持续16 周，发现体重与正常对照组无显著差异[16]，而笔者的研究中发现HCY 组14 周后体重不增加反而较N 组降低（P ＜0.05），在临床上也发现越来越多的非肥胖患者体检时会出现NAFLD，这是否与HCY 水平有关，值得进一步研究。

NAFLD 的发病率逐年升高，临床上，NAFLD形势十分严峻，其确切机制在很大程度上仍不清楚，目前研究者普遍应用高脂、高糖诱导的NAFLD 模型。然而不同致病因素所致脂肪肝模型的机制及病理改变各异，因此寻求复制率高、重复性好、方法较简便且满足研究目的的动物模型很有必要。目前文献报道的高脂饲料诱导的脂肪肝模型，造模耗时较长，且NAFLD 严重程度较低；叶酸缺乏诱导NAFLD 的研究尚少，本实验提供了一种叶酸缺乏导致非酒精性脂肪肝简单有效的方法，为预防和治疗叶酸缺乏相关NAFLD 的研究提供新思路：高同型半胱氨酸可导致高血压以及动脉粥样硬化等心血管疾病，这也为临床上NAFLD 伴动脉粥样硬化以及高血压的治疗研究提供了最直接的动物模型，除此之外，高同型半胱氨酸对肝脏造成损伤的同时抑制肝细胞再生，这也就提示了HCY 所造成的NAFLD 可能会由单纯的非酒精性脂肪肝发展为肝纤维化等肝脏病变，所以，本实验通过HCY 建立的NAFLD 动物模型对其治疗研究具有积极意义。研究结果还表明3 种不同饮食的干预所建立的模型存在差异，尤其体重最为明显，HFD 模型体重明显增加，而HCY 模型体重不增反而下降，FD 组体重无明显变化。众所周知，肥胖是导致NAFLD 的首要因素，但NAFLD 患者中，不乏体脂正常甚至偏低和营养缺乏的人群，结合本实验模型，HFD 模型很好的复制了肥胖导致NAFLD 的发病机制，值得进一步思考的是营养缺乏人群的NAFLD 发病机制是否与叶酸缺乏相关，体脂正常甚至偏低的人是否因高同型半胱氨酸导致NAFLD呢？

因此本研究通过比较3 种NAFLD 模型，联系临床实际为NAFLD 的病因、机制及防治研究提供合适理想的动物模型基础。