云南省不同产地三七的成分分析

孙孔春，吴乐艳，侯雯清，杨璨瑜，唐艳梅，沈报春

（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明 650500；2）云南经济管理学院医学院，云南昆明 650100）

三七[Panax notoginseng（burk.）F.H.Chen]又名田七，为五加科人参属植物，是我国传统的名中药材，具有散血止瘀、消肿定痛等功效，并有着“金不换”等美誉[1]。其性味甘、微苦、温，主要用于治疗咯血、外伤出血、跌打肿痛[2]。三七用于治疗疾病有悠久的历史，在《本草纲目》以前的《医门秘旨》、《跌损妙方》中已有记载[3]。药理资料证明[4-6]，三七在血液系统、神经系统、免疫系统、代谢系统、心血管系统、及抗炎、抗衰老、抗肿瘤等方面具有广泛的药理作用[7-14]。

三七主要有效成分为皂苷类化合物，随着现代分析测试仪器的广泛使用，使得对三七中皂苷类成分的提取、分离、鉴定及含量测定方法的研究取得极大进展。当前，已经从三七中分离提纯出近30种皂苷类成分，诸如Ginsenoside Rb1，Ginsenoside Rg1及Ginsenoside F2等[15]。

主要皂苷成分的含量是衡量三七药材品质的重要指标。2015 版《中国药典》[1]一部，三七的质量标准中规定“按干燥品计算，含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的总量不得少于5.0%”。因云南文山是公认的三七道地产区，云南省其他三七种植地也大多在文山州的周边地区，如红河、普洱、曲靖、昆明、玉溪等地[9]。为了考察云南其他产地的三七能否达到药典规定药用要求，本实验选取云南省不同产地21 批三七药材，对这3 种指标皂苷进行含量测定，检测云南不同产地三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1之和是否达到《中国药典》含量要求。

中药指纹图谱不仅具备个体的绝对唯一性，更强调的是物种特征的唯一性与同种个体之间的相似性。其以整体性以及模糊性等分析特点成为现阶段全面、整体控制中药质量最有效的方法，能全面反映中药所含化学成分的种类与数量，被国际社会认可，为中药及其产品进入国际市场奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪：包括G1332A真空脱气机、G1232C 二元泵、G1329B 标准型自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315D 检测器及Agilent 1200LC；色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；电子天平（BSA124S）：北京赛多利斯科学仪器有限公司；超声清洗仪（SK3200H）：上海科导超声仪器有限公司；0.22 μm 尼龙微孔滤头：天津市津腾试验设备有限公司；一次性使用无菌注射器5 mL、2.5 mL：陕西龙康鑫医疗器械有限公司；20 μL、100 μL、200 μL及1 000 μL 移液枪：Eppendorf Research plus。

1.2 实验样品及试剂

甲醇（分析纯，江苏汉邦科技有限公司）、乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）、三蒸水、磷酸（成都化夏化学试剂有限公司），三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1（上海源叶生物科技有限公司生产）；云南省各地三七药材根及根茎21 份，经昆明医科大学药学院刘毅教授鉴定为三七药材根及根茎。

1.3 对照品及供试品溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的配制 取三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，分别用60%甲醇超声溶解，均配制成浓度为1 mg/mL 的溶液，0.22 μm 微孔滤头过滤，取续滤液，作为对照品储备液。

1.3.2 供试品溶液的配制 将各产地的三七样品粉碎过四号筛，取样品约1 g，精密称定，置150 mL 具塞锥形瓶中加入50 mL 60%甲醇，精密称重，封口，置于超声震荡仪中超声30 min 使各皂苷成分浸出，取出放冷至室温，称重用60%甲醇补足减失重量，摇匀，0.22 μm 微孔滤头滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

1.4 正交实验

依据前期单因素试验的结果，选取各因素中对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb13 种目标产物提取效果有意义的水平做正交试验，确定最佳的提取条件。采用L9(34)正交表，以提取时间（A）、料液比（B）、甲醇体积分数（C）作为3 个考察因素，选取3 个水平进行试验。正交试验设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 方法学研究

1.5.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；进样量：10 μL；柱温：25℃；以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2。在此色谱条件下，取皂苷对照品和采自云南省文山丘北的三七样品分别进样分析。

表2 HPLC 梯度洗脱程序表Tab.2 The HPLC gradient elution procedures

1.5.2 线性关系的考察 精确称取三七皂苷R1对照品，按照1.3.1 下方法配制得到0.0625 mg/mL 的对照品溶液，再按2.2.1 下色谱条件分别进样5、10、20、40、80 μL，记录保留时间和峰面积；精确称取人参皂苷Rb1对照品，按照1.3.1 下方法配制为0.25 mg/mL 的对照品溶液，再按2.2.1 下色谱条件分别进样10、20、25、30、35 μL，记录保留时间和峰面积；精确称取人参皂苷Rg1对照品，按照1.3.1 下方法配制为0.25 mg/mL 的对照品溶液，再按2.2.1 下色谱条件分别进样5、20、40、50、60 μL，记录保留时间和峰面积。

1.5.3 精密度和重复性试验 精密吸取1.3.2 下方法配制的同一份供试样品溶液，按2.2.1 下色谱条件连续进样6 次，记录3 种有效成分的保留时间及峰面积；取同一份供试药材，按1.3.2 下方法平行操作制备5 份样品，分别按2.2.1 下色谱条件进样，记录3 种有效成分的保留时间及峰面积，计算各物质保留时间和峰面积的RSD%，分别考察改方法的精密度和重复性。

1.5.4 稳定性试验 按1.3.2 下方法配制供试样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 按2.2.1 下色谱条件进样10 μL 测定，记录3 种有效成分的保留时间及峰面积，计算各物质的保留时间和峰面积的RSD%。

1.5.5 回收率 向已知被测成分含量的三七样品供试品中，精密加入一定量的被测成分对照品，计算实测值与供试品中含有量之差，再除以加入对照品量计算回收率。

1.6 样品含量测定

取云南不同产地的21 份三七样品，分别按1.3.2 下方法配制成供试品溶液，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录保留时间及峰面积，将所得结果带入3 种皂苷的标准曲线，计算云南不同产地三七样品中3 种皂苷的含量。

1.7 HPLC 指纹图谱建立

将各产地批次三七样品按1.3 下方法配制成供试品溶液，按2.2 方法下高效液相色谱实验条件进样10 μL 进行分析，记录色谱图。选取参照峰（S），记录样品出峰总个数及共有峰个数，计算共有峰的相对保留时间，相对保留时间的相对标准偏差（RSD%）。

2 结果

2.1 正交实验结果

按表1 的正交因素水平表设计正交试验，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的正交实验结果及方差分析结果分别列于表3 至表8。

由表3～表8 的极差结果及方差结果可以看出：对于三七皂苷R1、人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1而言，3 个因素中对其提取量的影响大小依次为料液比（B）＞甲醇体积分数（C）＞提取时间（A），在试验设计范围内，得到三七皂苷R1的最佳提取工艺A2B3C1，即提取时间30 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇体积分数60%；人参皂苷Rg1的最佳提取工艺是A3B3C1，即提取时间45 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇体积分数60%；人参皂苷Rb1的最佳提取工艺是A2B3C1，即提取时间30 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇体积分数60%。

综合3 种物质的提取工艺，最终选择超声提取时间30 min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇体积分数60%为超声同时提取三七中有效成分的最佳提取工艺。

2.2 方法学研究结果

2.2.1 三七中各皂苷及样品HPLC 色谱图 按对照品及供试品溶液配制方法操作，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品溶液色谱图见图1，采自文山丘北三七样品色谱图见图2。理论塔板数按三七皂苷R1峰计在6×103以上；各皂苷与相邻色谱峰间的分离度均大于1.5。

表3 L9（34）正交试验结果（三七皂苷R1）Tab.3 The results of orthogonal experiment（Panax Notoginseng Saponins R1）

表4 三七皂苷R1正交实验方差分析表（α=0.05）Tab.4 Analysis of orthogonal experiment variance of Panax Notoginseng Saponins R1（α=0.05）

表5 L9（34）正交试验表（人参皂苷Rg1）Tab.5 The results of orthogonal experiment（Ginsenoside Rg1）

表6 人参皂苷Rg1正交实验方差分析表（α=0.05）Tab.6 Analysis of orthogonal experiment variance of Ginsenoside Rg1（α=0.05）

表7 L9（34）正交试验表（人参皂苷Rb1）Tab.7 The results of orthogonal experiment(Ginsenoside Rb1）

表8 人参皂苷Rb1正交实验方差分析表（α=0.05）Tab.8 Analysis of orthogonal experiment variance of Ginsenoside Rb1（α=0.05）

图1 三七皂苷混标色谱图Fig.1 The chromatograms of Panax Notoginseng Saponins

图2 三七样品色谱图Fig.2 The chromatogram of the panax notogiseng sample

2.2.2 线性关系 按线性关系考察方法操作，将结果以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的回归方程和相关系数见表9。

2.2.3 精密度试验和重复性试验 按精密度和重复性考察方法操作，记录峰面积，精密度实验计算得到样品中3 种有效成分峰面积的RSD%分别为R1=0.45%，Rb1=0.23%，Rg1=0.09%，结果表明仪器精密度和操作精密度良好；重复性实验计算得到样品中3 种有效成分峰面积的RSD%分别为R1=1.59%，Rb1=0.51%，Rg1=0.54%均符合规定，结果表明方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 按稳定性考察方法操作，记录峰面积，稳定性实验计算得到样品中3 种有效成分峰面积的RSD%分别为R1=1.45%，Rb1=1.41%，Rg1=0.81%，结果表明样品溶液在24h 内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率 按加样回收率考察方法操作，记录峰面积，计算得到样品中3 种有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg1的加样回收率，具体结果见表10，加样回收率均在各自范围内，结果表明方法准确度可靠。

2.3 含量测定结果

按含量测定方法操作，记录保留时间及峰面积，将所得结果带入表9 下3 种皂苷的标准曲线，计算云南不同产地三七样品中3种皂苷的含量，结果见表11。

表9 三七皂苷、人参皂苷的回归方程Tab.9 The regression equation of panax notoginseng Saponins，ginsenoside

表10 加标回收率试验结果Tab.10 The result of recovery rate test

2.4 指纹图谱结果

按2.4 下方法操作，记录色谱图，分析可得：组分在60 min 内出峰完全，检测系统无干扰峰，样品出峰个数为32 个，对比保留时间，确定样品中tR=22.805 min 峰为人参皂苷Rb1，人参皂苷Rb1与相邻峰分离良好，选做参照峰（S），确定23 个共有峰，共有峰总数比例达到71.88%，计算共有峰的相对保留时间的RSD（%）为0.001%～0.018%（表12）。同时导入HPLC 色谱分离图，采用药典委员会推荐的中药色谱指纹评价系统进行叠加比较，见图3。

3 讨论

药理资料证明三七具有抗血栓、改善心血管功能和很强的止血作用。三七主要以地下部位入药，其主要成分为达玛烷型四环三萜皂苷，其中以人参皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1的含量最高。主要皂苷成分的含量是三七药材品质分析的重要指标。

在前期实验中，通过单因素实验探索提取时间、料液比、溶剂体积分数对三七中3 种主要指标成分的提取率的最佳提取参数，利用L9（34）正交试验设计得出最佳工艺条件为提取时间30min、料液比1.0 g/50 mL、甲醇体积分数60%。本实验所采用的超声提取法提取三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1，该方法具有耗时短、效率高、耗能少等优点。

表11 云南省不同产地三七中3 种主要皂苷含量结果Tab.11 The results of three main saponins content in panax notoginseng from YunNan different places

表12 21 批药材共有指纹峰的相对保留时间（1）Tab.12 The common peaks,relative retention time of 21 batches（1）

表12 21 批药材共有指纹峰的相对保留时间（2）Tab.12 The common peaks,relative retention time of 21 batches（2）

图3 三七的高效液相色谱叠加图Fig.3 The overlaied HPLC chromatograms of Panax Notoginseng

中华人民共和国药典2015 版[1]采用HPLC 法对三七中的人参皂苷Rg1、Rb1、及三七皂苷R1进行定量[7]，本试验所建立的含量测定方法基于2015版中华人民共和国药典方法对流动相梯度进行优化而得，其具有简便、准确，精密度和重复性均好等特点，可用于三七药材中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量测定。

含量测定结果表明云南不同产地三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb13 种主要皂苷含量之和在5.30%～9.95%之间，均大于药典规定值5.0%，达到《中国药典》[1]对三七的质量标准要求。

从表12 可知：三七样品中共有峰占总峰的比例达到71.88%，相对保留时间的RSD（%）为0.001%～0.018%。综合含量测定结果与共有峰的相对保留时间RSD（%），可看出不同产地三七样品所含物质基本一致，且三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb13 种主要皂苷含量已达2015 版《中国药典》规定。随着市场需求的增加，三七出现供不应求的局面，本实验研究结果为异地种植三七提供技术支持。

本实验通过测定三种皂苷含量及共有峰的相对保留时间RSD（%）对云南不同产地三七进行质量分析，方法简便、灵敏、准确度高。与单独控制三种皂苷的含量相比，增加药材的HPLC 指纹图谱，对药材的全面质量控制大有增益。此外，本方法也可用于其他地区产三七的质量分析和质量评价。