帕瑞昔布钠对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角胶质纤维酸性蛋白及脊髓炎性反应的影响

刘少星，谢先丰，曹德钧

（成都市第二人民医院麻醉科，四川成都 610017）

神经病理性疼痛是以痛觉过敏、自发性疼痛为特征的疼痛类型，神经免疫系统紊乱、炎症介质异常分泌所引起的外周敏化和中枢敏化是造成神经病理性疼痛的关键环节，该过程也被称为“神经源性炎症”[1]。脊髓背角星形胶质细胞在外周神经损伤过程中过度活化并释放炎性细胞因子是病理性疼痛发生发展过程中重要的因素之一，而环氧合酶-2（COX-2）作为介导神经炎性反应的关键酶参与神经病理性疼痛的重要发生发展过程[2-3]。帕瑞昔布钠是一种静脉用高选择性COX-2抑制剂，广泛应用于手术患者的超前镇痛和术后疼痛治疗。本研究拟建立大鼠坐骨神经结扎的经典神经病理性疼痛模型（CCI），观察帕瑞昔布钠静脉注射对大鼠热痛阈、机械痛阈及脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）表达、脊髓中COX-2 及脊髓炎性细胞因子IL-1β 及TNF-α 含量的影响，探讨帕瑞昔布钠静脉给药对神经病理性疼痛大鼠的影响及机制，为帕瑞昔布钠在神经病理性疼痛方面的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择及分组

健康成年雄性SD 大鼠42 只，体重250～300 g，8～10 周龄，由四川大学华西医学麻醉与危重病实验中心提供，采用随机数字表法分为3 组（n＝14）：假手术组（S 组）、神经病理性痛组（CCI 组）、帕瑞昔布钠组（P 组）。

1.2 大鼠神经病理性疼痛模型制备

参照文献[4]，采用坐骨神经慢性结扎损伤法（CCI）制作大鼠神经病理性疼痛模型，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉，待翻正反射消失后，俯卧位固定，右后肢备皮消毒，于大腿中部外缘切开皮肤，钝性分离肌肉，游离坐骨神经主干长约7 mm，用4-0 铬制肠线于坐骨神经主干分别结扎4 道结扎环，环间间隔约1 mm，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颠动为宜，丝线逐层缝合肌肉及皮肤；S 组仅游离出坐骨神经主干不结扎，P 组在皮肤缝合结束后即刻经鼠尾静脉注射帕瑞昔布钠10 mg/kg（批号85820004，Pfizer 公司，美国），连续3 d。术毕将大鼠放入鼠笼，于温暖、安静环境自由单笼喂养。S 组、CCI 组在相同时点经尾静脉注射等容量的生理盐水。模型制备由同一人完成，术中烤灯照射维持直肠温度约37℃。

1.3 机械痛阈和热痛阈的测定

分别于术前1 d、术后4 d、7 d、14 d 时测定机械痛阈和热痛阈。机械痛阈测定:在安静的环境中，将大鼠置于金属网格笼子中，待大鼠安静且足底伸展适中后，用Electronic von Frey 触觉测痛仪（2392 型）垂直刺激大鼠右足底中部并记录大鼠出现抬足、躲避、舔足等动作时的刺激力度；每只大鼠重复测量5 次，每次间隔大于10 s，取平均值作为机械痛阈。热痛阈测定：在安静的环境中，将大鼠放入厚度为6 mm 的透明有机玻璃箱内，待大鼠安静且足底伸展适中后。用Series8 型热测痛仪照射大鼠右后足底中部，待大鼠产生快速缩足、扬足或舔足后停止照射，记录照射时间；每只大鼠重复测量5 次，每次测量间隔5 min。取平均值作为热痛阈。

1.4 脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的测定

于术后14 d 在测定机械痛阈和热痛阈后1 h，各组随机取7 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉，断头处死大鼠，于冰皿上分离取L4-6脊髓节段置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后石蜡包埋、切片，组织切片脱蜡脱水，免疫组化SP 法检测GFAP，DAB 显色，免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物技术公司。由另一观察者在不知分组情况下每只动物选取5 张切片在400 倍视野下随机选取右侧脊髓背角内不重叠的5 个视野，计数视野中GFAP 阳性细胞数，以平均值表示GFAP 表达值。

1.5 脊髓COX-2、IL-1β、TNF-α 含量的测定

各组中剩余7 只大鼠麻醉，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉，处死大鼠，于冰皿上分离取L4-6 脊髓节段，称重后按1:9 比例加入冷PBS液，制成10%脊髓组织匀浆，4℃下3 000 r/min 离心20 min 收集上清液。采用ELISA 法测定COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量，严格按照试剂盒（R&D 公司，美国）说明书要求进行操作。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 热痛阈、机械痛阈的改变

术前1 d 时各组大鼠热痛阈、机械痛阈无统计学差异（P ＞0.05）；与S 组比较，CCI 组和P 组术后4 d、7 d、14 d 时热痛阈、机械痛阈明显降低（P＜0.05），与CCI 组比较，P 组术后4 d、7 d、14 d 时热痛阈、机械痛阈明显升高（P＜0.05）见表1。

2.2 脊髓背角GFAP 及脊髓中COX-2、IL-1β、TNF-α 的改变

S 组大鼠术后14d 时右侧脊髓背角GFAP 阳性细胞表达数少，形态正常，分支少；与S 组比较，CCI 组大鼠术后14d 右侧脊髓背角GFAP 阳性细胞表达数明显增多（P＜0.05），体积增大，分支增多，较多突起断裂，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量升高（P＜0.05）。与CCI 组比较，P组大鼠术后14d 右侧脊髓背角GFAP 阳性细胞表达数明显减少（P＜0.05），体积减小，突起及分支减少，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量降低（P＜0.05），见表2、图1。

表1 4 组大鼠不同时点痛阈的比较［n=14，（）］Tab.1 Comparison of pain threshold at different time points among the 3 groups ［n=14，（）］

表1 4 组大鼠不同时点痛阈的比较［n=14，（）］Tab.1 Comparison of pain threshold at different time points among the 3 groups ［n=14，（）］

与S 组比较，*P＜0.05；与CCI 组比较，▲P＜0.05；与术前1 d 比较，＃P＜0.05。

表2 术后14 d 各组大鼠脊髓GFAP、COX-2、IL-1β 及TNF-α 的比较［n=7，（）］Tab.2 Comparison of GFAP，COX-2，IL-1β and TNF-α in the spinal cord of rats in each group at 14 days after operation ［n=7，（）］

表2 术后14 d 各组大鼠脊髓GFAP、COX-2、IL-1β 及TNF-α 的比较［n=7，（）］Tab.2 Comparison of GFAP，COX-2，IL-1β and TNF-α in the spinal cord of rats in each group at 14 days after operation ［n=7，（）］

与S 组比较，*P＜0.05；与CCI 组比较，▲P＜0.05。

图1 术后14 d 时各组大鼠脊髓背角GFAP 对比（×40）Fig.1 Comparison of GFAP in rats spinal dorsal horn in each group at 14 days after operation（×40）

3 讨论

本研究参考文献[4]采用结扎坐骨神经干的方法制备大鼠神经病理性疼痛模型。本研究结果表明，CCI 组和P 组大鼠在术后均出现右后爪内收畸形，后肢保护等表现；与S 组比较，CCI 组和P 组大鼠在术后各时术后4 d、7 d、14 d 均出现热痛阈、机械痛阈明显降低，提示模型制备成功。

本研究参照文献[5]采用经鼠尾静脉注射帕瑞昔布钠剂量10 mg/kg，结合临床使用帕瑞昔布钠用于术后镇痛用药时间通常不超过3 d，选择术后连续3 d，并于术后第4 天、7 天、14 天检查各指标。本研究结果显示，与CCI 组比较，P 组术后4 d、7 d、14 d 机械痛阈和热痛阈升高，提示帕瑞昔布钠10 mg/kg 静脉注射可减轻大鼠神经病理性疼痛。

星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的胶质细胞系成员，主要为神经细胞提供营养和支撑，并具有调节离子平衡和神经递质、维持血脑屏障稳定等重要作用[6，7]。周围神经及腰脊神经结扎、脊髓创伤等可引起星形胶质细胞激活而进入活化状态，发生增生、肥大并进入增殖状态，形成反应性星形胶质细胞增生；过度活化的星形胶质细胞可分泌活性氧、前列腺素、氧化亚氮、神经生长因子等神经活性物质及多种炎性因子，使神经细胞处于敏化状态[8]。GFAP 是星形胶质细胞的特异性蛋白和骨架标记物，是星形胶质细胞成熟的标志[9]。Liu 等[10]研究发现神经病理性痛大鼠模型制备成功后24～48 h，外周神经结扎侧脊髓背角星形胶质细胞开始被激活，GFAP 表达增加，第14 天时最明显且其激活程度与触诱发痛正相关，因此本研究在模型制备后14 d 检测脊髓中GFAP、COX-2 和炎症因子TNF-α、IL-1β 含量。在大鼠CCI 模型中，外周神经损伤后脊髓背角星形胶质细胞被激活后发生细胞形态、功能改变，星形胶质细胞突触后的树突中COX-2mRNA 与蛋白水平迅速升高，释放神经毒性物质如IL-1β、TNF-α、IL-6、氧自由基、谷氨酸、P 物质等参与中枢敏化引发疼痛[11-13]。过度表达的炎症因子TNF-α、IL-β 又可以促进星形胶质细胞活化[14-16]。抑制星形胶质细胞功能可以明显减轻痛觉过敏现象[17-18]。COX-2 是花生四烯酸代谢途径限速酶之一，有研究表明TNF-α、IL-β 可通过环氧合酶通路参与脊髓水平的伤害信息的传递和加工使脊髓中伤害感受过程易化，促进炎性反应，参与中枢敏化[19-20]。本研究结果表明，S 组术后14 d 时大鼠脊髓背角GFAP 阳性细胞表达数少，形态正常，分支少；与S 组比较，CCI 组术后14d 时GFAP 阳性细胞表达数明显增多，体积增大，分支增多，可见较多突起断裂，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α含量升高；与CCI 组比较：P 组术后14d 时GFAP阳性细胞表达数明显减少，体积减小，突起及分支减少，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量降低。提示帕瑞昔布钠10mg/kg 静脉注射减轻神经病理性疼痛的机制与抑制脊髓背角星形胶质细胞过度活化释放COX-2，抑制炎症细胞因子IL-1β、TNF-α 表达有关。

综上所述，帕瑞昔布钠静脉注射可通过抑制脊髓背角星形胶质细胞过度活化，降低脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量，减轻脊髓炎性反应，减轻大鼠神经病理性疼痛。