PTEN 基因调控Raf-1 磷酸化对前列腺癌PC3 细胞凋亡的影响

孙健玮，王剑松，刘子超，郑立民

（1）昆明医科大学第五附属医院超声科，云南个旧 661000；2）昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，云南昆明 650101；3）昆明学院生命科学与技术系，云南昆明 650214；4）昆明医科大学第五附属医院泌尿外科，云南个旧 661000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）多发于老年男性，其发病率近年来呈明显上升趋势[1]，大多数病例由于内分泌治疗产生抵抗而出现复发、转移和死亡。目前尚缺乏PCa 早期诊断的分子生物学检测标记物以及治疗的分子靶向药物，对PCa 发生发展的分子生物学基础研究已成为热点。

PCa 的发生发展受多基因及多信号转导通路的调控。第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）属于抑癌基因，多种肿瘤的发生与其表达水平降低或丢失关系密切[2]。多种原因导致的PTEN 基因表达减低或缺失可经由多个信号转导通路影响PCa 的发生发展[3]。细胞凋亡（apoptosis）也称程序性细胞死亡，此过程以维持内环境稳定为目的，是肿瘤细胞生存的重要影响因素之一，参与肿瘤的发生发展过程。作为真核细胞信号转导网络途径之一的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号转导通路，以高度保守的三级激酶级联形式激活并在磷酸化状态下将上游信号传递到下游应答分子，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥重要的作用，Raf-1 即为该信号转导通路中重要节点之一。PTEN 基因对细胞凋亡的调控是否与MAPK 信号通路中信号转导关键位点Raf-1 有关尚不能确定。本研究通过改变PTEN 基因表达，检测磷酸化Raf-1水平并抑制相关信号通路中Raf-1 的上游作用点，再对PC3 细胞凋亡进行测定，旨在探讨PTEN 基因的表达对Raf-1 磷酸化的调控作用并进一步对前列腺癌PC3 细胞凋亡的影响，为PCa 的临床诊治应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

前列腺癌PC3 细胞购自中国科学院典藏委员会昆明细胞库；脂质体Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX Reagent 和Opti-MEM I Medium培养基购自美国Invitrogen 公司；PTEN-pCMV6 载体购自美国Origene 公司；si-PTEN RNA 购自Qiagen 公司；PTEN 抗体（GTX101025）购自美国GeneTex 公司；Caspase-8 抗体（8CSP03）、Caspase-9（96-1-23）、Caspase-3 抗体（3CSP01）购自美国CST 公司，Caspase-12 抗体（D-20）购自美国Abcam 公司；Bax 抗体（2D2）和Bcl-2 抗体（C-2）购自美国Santa Cruz 公司；β-tubulin 抗体购自美国Epitmics 公司；FTS 和MK2206 2HCl 分别购自美国Sigma 公司和Selleck 公司；MTT 试剂盒、碘化丙啶购自美国BD 公司；胎牛血清购自Gibco 公司。

1.2 细胞培养

细胞培养液为含10%胎牛血清、10 ng/mL EGF和1%青链霉素双抗的DMEM/F12 培养基，PC3 细胞在37℃、5%CO2恒温箱培养中培养，2～3 d 更换培养液，0.25%胰酶消化传代。取对数期细胞用于实验。

1.3 细胞的瞬时转染

在24 孔细胞培养板内加入500 μL 对数期细胞悬液（1×105个/孔），过夜培养后加入FTS（150 μmol/L）和MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用48 h 后以Western Blot 检测ERK 和AKT 表达程度，以空白抑制剂组作对照。8 μg PTEN-pCMV6 载体质粒和10 μL 的Lipofectamine 2000 分别用250 μL的Opti-MEM 稀释，放置5 min 后混匀，再室温放置25 min 后加入到细胞培养板中，6 h 后换成完全培养液，转染48 h后用Western Blot 检测PTEN 基因表达水平和磷酸化Raf-1 表达水平。光镜下观察PC3 细胞形态、MTT 检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western Blot 检测Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3表达水平。空质粒做对照。

1.4 细胞的干扰

在24 孔细胞培养板内加入500 μL对数期细胞悬液（2×105个/孔），过夜培养后加入FTS（150 μmol/L）和MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用48 h 后以Western Blot 检测ERK 和AKT 表达程度，以空白抑制剂组作对照。0.7 μL 的20 μM si-PTEN RNA 及1 μL Lipofectamine RNAiMAX 分 别 用50 μL的Opti-MEM稀释放置5 min 后混匀，在室温放置18 分钟后加入到24 孔板中并加200 μL 的opti-MEM，6 h 后换成含完全培养液。转染48 h 后用Western Blot 检测PTEN 基因表达程度和磷酸化Raf-1 表达水平。光镜下观察PC3 细胞形态、MTT检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western Blot 检测Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 表达水平。control siRNA 做对照。

1.5 Western blot 检测

各转染组细胞用胰酶消化后，加入细胞裂解液裂解并离心提取蛋白质，Bio-rad 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。等量的总蛋白经煮沸变性后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法转膜，5%奶粉溶液封闭2 h，一抗孵育过夜，二抗孵育4 h，滴加适量ECL 化学发光底物，显影。采用Quantity One 软件测定条带灰度值。实验重复3 次。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 ERK 和AKT 表达的测定

Ras 抑制剂FTS（150 μmol/L）和AKT 抑制剂MK2206 2HCl（3 μmol/L）作 用PC3 细 胞48 h，Western Blot 检测ERK 和AKT 表达量分别较空白抑制剂对照组减低49.80%（P＜0.01）和51.62%（P＜0.001），见图1C-图C。

图1 ERK 和AKT 表达的测定Fig.1 The expression of ERK and AKT

2.2 PTEN 基因表达和Raf-1、磷酸化Raf-1 表达的测定

以载体质粒PTEN-pCMV6 经Lipofectamine 2000 转染PC3 细胞，48 h 后进行Western Blot 检测，PTEN 基因表达量较对照组显著增加（P＜0.01）；磷酸化Raf-1 表达量Raf-1 显著降低（P＜0.01）；Raf-1 表达量与对照组无明显差异（P=0.95），见图2。

以 si-PTEN 干 扰 RNA 经 Lipofectamine RNAiMAX 转染PC3 细胞，48 h 后进行Western Blot 检测，PTEN 基因表达量分别较对照组显著减少（P＜0.05）；磷酸化Raf-1 表达量显著增加Raf-1（P＜0.01）；Raf-1 表达量与对照组无明显差异（P=0.34），见图3。

2.3 PTEN 基因表达变化对PC3 细胞凋亡的影响

FTS（150 μmol/L）和 MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用PC3 细胞，经转染过表达和干扰48 h 后对PC3 细胞凋亡的相关指标进行检测。

2.3.1 PC3 细胞光镜下形态变化 PTEN 过表达后，光镜下见PC3 细胞出现凋亡的改变，表现为细胞变形，体积缩小，细胞核固缩。干扰PTEN 表达减少后，光镜下PC3 细胞形态、数目以及体积、细胞核形态的变化无显著差异，见图4。

图2 PTEN 过表达时Raf-1 和磷酸化Raf-1 的表达Fig.2 The expression of Raf-1 and phosphorylated Raf-1 when PTEN was overexpressed

图3 PTEN 干扰时Raf-1 和磷酸化Raf-1 的表达Fig.3 The expression of Raf-1and phosphorylated Raf-1 when PTEN was silenced

图4 PTEN 基因表达变化PC3 细胞凋亡的光镜下表现（×200）Fig.4 The apoptosis of PC3 when PTEN's expression was changed（×200）

2.3.2 MTT 测定PC3 细胞OD 值和细胞活力PTEN 过表达和干扰时，MTT 测定PC3 细胞OD 值分别为（0.354±0.048）和（0.690±0.084），计算细胞活力分别为（41.42±2.88）%和（95.36±7.75）%。与各对照组相比较，PTEN 基因过表达时PC3 细胞活力减低（P＜0.01），PTEN 基因干扰时PC3 细胞活力变化无显著差异（P=0.41）。

2.3.3 Annexin V-FITC 和PI 双染色流式细胞仪检测PC3 细胞凋亡率 PTEN 过表达时，PC3 细胞凋亡率为（22.10±2.29）%，较对照组（6.37±0.76）%增高（P＜0.01）。PTEN 干扰时，PC3 细胞凋亡率为（7.47±0.74）%，与对照组（6.57±0.78）%比较无显著差异（P=0.22），见图5。

2.3.4 Western blot 测 定 Bax、Bcl-2、caspase-8、caspase-9、caspase-12 和caspase-3的表达水平 PTEN 过表达时，促凋亡蛋白Bax 以及凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 的表达量较对照组增高（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平较对照组减低（P＜0.01）。PTEN 基因干扰时，促凋亡蛋白Bax 以及凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 的表达量较对照组减低（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平较对照组增高（P＜0.01），见图6。

图5 PTEN 基因表达变化流式细胞仪检测PC3 细胞凋亡率Fig.5 The apoptosis rate of PC3 by flow cytometer when PTEN's expression was changed

图6 PTEN 基因表达变化相关凋亡蛋白及Bax/Bcl-2 蛋白表达Fig.6 The expression of caspase and Bax/Bcl-2 when PTEN'expression was changed

3 讨论

PCa 是近年老年男性发病率最高的癌症之一，它具有与雄激素相关的特性，激素剥夺治疗被认为是有效的治疗手段，但大多数病例后期治疗效果极为有限并最终导致内分泌治疗抵抗而预后不佳，因此对PCa 发病机制及其治疗手段研究成为肿瘤研究领域的热点。

激素非依赖性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC）包括雄激素非依赖性前列腺癌和激素抵抗性前列腺癌，虽经过内分泌治疗仍出现复发和进展[5]。除雄激素受体（androgen receptor，AR）表达异常、配体、共调节因子等作用机制外，细胞信号转导通路凭借其重要的生物学功能在AIPC 的发生发展过程中具有重要的作用[6]。目前磷脂酰肌醇3 激酶/ 丝苏氨酸激酶（PI3K/AKT）和丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号转导通路在AIPC 发生机制中的作用研究较为深入，前者主要与细胞的存活有关，可调控AR 的转录和稳定性进而相互协同促进AIPC 的发生与发展[7]，后者主要在细胞增殖、分化、周期调控以及细胞凋亡等方面导致AIPC 的转化[8]。MAPK/ERK 信号转导通路中，Raf分为A-Raf、B-Raf 和C-Raf（Raf-1），被启动信号Ras 磷酸化的Raf-1 具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，通过激活下游因子MAPK 激酶（MEK1/2）和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）进而影响胞浆蛋白磷酸化、细胞骨架成分磷酸化以及胞核转录因子、核蛋白磷酸化等生物学过程。该信号转导通路中自分泌和旁分泌生长因子所导致的Ras 和Raf 激活可推进AIPC 的病程进展并在PCa 的转移过程中发挥重要的作用[9]。除Ras 外，Raf-1 也可能被其他上游信号蛋白甚至是PI3K/AKT 通路中的AKT所调控，Raf-1 是PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信号通路间相互作用的交汇点之一[10]。

抑癌基因PTEN 具有双重特异性磷酸酶活性，主要通过细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞迁移等环节发挥抑癌功能，PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信号转导通路的平衡是其调控作用的关键[11]。PTEN 可特异性诱导细胞周期素依赖激酶（CDKs）抑制因子p21、p27 和p51 参与细胞周期的调控[12]。PTEN 基因表达的缺失普遍存在于PCa 并增强AR 的激活和表达而可能成为AIPC 进展的关键原因之一[7，13]。

本研究表明，PC3 细胞分离自人前列腺癌骨转移肿瘤，分化程度低，具有AIPC 的特性，当使用FTS（Farnesylthiosalicy acid）选择性抑制Ras 法尼酰基转移酶活性、MK2206 2HCl 高度选择性抑制AKT 活性以排除Ras 和AKT 对Raf-1 的干扰，PTEN 基因过表达时PC3 细胞的Raf-1 活性出现抑制（即磷酸化Raf-1 表达减低），PTEN 基因表达减低后PC3 细胞Raf-1 的活化增加（即磷酸化Raf-1 表达增加），而非磷酸化Raf-1 的水平与PTEN 基因的表达变化无相关性。提示在MAPK/ERK 信号转导通路中除Ras 外，PTEN 基因可对Raf-1 的活化进行负调控。Raf-1 作为PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信号转导通路之间重要的交汇点之一，除接受Ras 和AKT 信号蛋白的激活外也能被PTEN 基因所调控，成为PTEN 基因在MAPK/ERK 信号转导通路中除Ras 外新的作用位点。PTEN 基因对Raf-1 负调控作用有助于揭示AIPC 的发生机制，并可为针对PTEN、Ras、Raf-1等信号通路中关键因子进行靶点治疗提供重要的分子生物学理论基础。

细胞凋亡是由基因调控、程序性死亡的过程，在维持细胞增殖的动态平衡以及促进肿瘤细胞的异常增殖方面具有重要的作用。参与细胞凋亡的三个主要通路包括死亡受体通路、线粒体通路和内质网应激通路。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Crysteiny aspartate-specific proteinases，caspase）的激活是细胞凋亡的关键步骤[14]，不同的Caspase家族成员所发挥作用不尽相同，其中Caspase-2、Caspase-8 和Caspase-9 在自我活化的同时能识别激活下游信号分子而具有凋亡启动功能[15-16]，Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 发挥推进和执行凋亡过程的作用，Caspase-3 的活化推动细胞凋亡的不可逆性[17-18]，而caspase-12 则是内质网应激通路诱导细胞凋亡的重要标志[19]。参与细胞凋亡的不同通路存在多个交汇点，如Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 以及Bax/Bcl-2，形成细胞凋亡复杂而重要的网络作用机制。细胞凋亡受多种因素的调控和影响，其中MAPK 相关信号转导通路对细胞凋亡具有重要的调控作用[20]。

原癌基因Bcl-2 的表达产物具有抑制细胞凋亡的作用，Bax 基因编码的蛋白位于细胞浆并与Bcl-2 存在21%的同源性，转移至线粒体的Bax 分子中BH3 能与Bcl-2 形成杂二聚体对抗Bcl-2 的凋亡抑制作用进而发挥促凋亡功能[21]。Bax/Bcl-2蛋白间竞争性二聚化作用决定细胞在接受凋亡信号刺激时是否发生凋亡，如Bax 和Bcl-2 均衡表达、Bax/Bcl-2 异二聚体占优势时表现为细胞存活期正常，若Bax 或Bcl-2 任意一方过表达所形成的Bax/Bax 或Bcl-2/Bcl-2 同二聚体占优势则出现诱导细胞凋亡或抑制细胞凋亡的效应[22]。Bax 和Bcl-2是细胞凋亡的重要影响因素，二者的平衡直接关系到细胞凋亡的关键调控[23]。

本研究显示，FTS 和MK2206 2HCl 作用后的PC3 细胞在PTEN 基因过表达、Raf-1 活性抑制时，PC3 细胞光镜下凋亡的改变明显增加，同时细胞活力降低、细胞凋亡率增加，凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3 以及促凋亡蛋白Bax 表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 则呈低表达；而PTEN 基因干扰低表达、Raf-1 活性增高后，凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3 以及促凋亡蛋白Bax 表达减低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达增加，提示PTEN 基因在负调控Raf-1磷酸化的同时，诱导并促进PC3 细胞的凋亡，并且在此过程中死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径均有可能参与其中，进一步预示PTEN 基因可能通过对Raf-1 的调控实现MAPK/ERK 信号转导通路活性的抑制以及促凋亡和抗凋亡因素平衡的调整以诱导并促进PC3 细胞的凋亡。本研究中PTEN 基因干扰后其表达减低，在光镜下未观察到PC3 细胞形态的明显变化，同时PC3 细胞活力测定值和细胞凋亡率与对照组比较无显著变化，提示PTEN 基因干扰表达减低时虽有促凋亡的因素减少和抗凋亡的因素的增多，但决定PC3 细胞出现凋亡抑制效应是否还存在Bax/Bcl-2 表达比例以及其他相关的影响因素，有待于进一步深入研究。

本研究结果提示PTEN 基因对MAPK/ERK 信号转导通路中Raf-1 具有负调控作用并进一步影响PC3 细胞的凋亡过程。针对包括Raf-1 在内的MAPK/ERK 信号转导通路的关键信号蛋白以及Caspase 家族、Bax/Bcl-2 等凋亡因子，可为PCa 和AIPC 诊治新靶点的研究提供理论基础。尽管本研究根据细胞凋亡信号因子作用的相关顺序和作用模式可对PC3 细胞凋亡的机制进行一定的推断，但细胞信号转导通路内部和通路之间存在交汇和重叠，凋亡因子之间也存在复杂的交互作用，MAPK/ERK 信号转导通路中MEK/ERK 等其他重要信号蛋白是否参与PC3 细胞的凋亡，PC3 细胞凋亡的诱导和进程中各关键因子全面、精准的作用模式和作用位点有待进一步完善研究。