应用QF-PCR和CNV-seq以及染色体核型分析检测羊水的染色体畸变及结果分析

乔金平 胡文君 陈薇 刘慧 张小鹏 代雅倩 彭丽朵 徐元宏 方慧琴★ 袁静★

出生缺陷在我国的发生率约5.6%，而以染色体数目异常、大片段缺失或重复及致病性基因组致病性拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）等为主的染色体畸变约占出生缺陷的遗传学病因的80%以上[1-2]。染色体核型分析技术（下文简称为核型分析），是染色体疾病确诊的金标准之一，但需要细胞培养，存在检测时间长、通量低、分辨率较低（无法检出5Mb以下的CNV）等诸多不足，已无法满足日益增长的产前诊断需求[2]。基于低深度全基因组测序的基因组拷贝数变异测序（Copy Number Variation Sequencing，CNV-seq）技术由于其具有检测覆盖面广、通量高、易操作、所需DNA样本量低等诸多优点已被广泛应用于包括非整倍体、微缺失、微重复等在内的染色体畸变的检测[1]。基于短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR）为核心的定量荧光PCR（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF-PCR）技术具有通量高、速度快（可以在数小时内完成检测并出具报告）、可检测母血污染、准确性高[能诊断出99.2%～100.0%目标染色体（21、18、13、X和Y共5种染色体）的非整倍体异常][3-4]等特点。结合各自的优势和互补性，QF-PCR和CNV-seq的联合使用可用于替代核型分析已成为专家共识[1]，因此这两种技术的联合使用已逐渐普及，为有产前诊断需求的人群，特别是无法做核型培养的人群提供了较好的选择。本研究通过对比分析本院106例QF-PCR联合102例CNV-seq及4例核型分析的检测情况，探讨这些技术在染色体畸变诊断中的临床应用价值及联合检测的优势。

1 材料与方法

1.1 材料

2019年5月至2019年9月因高龄、血清学唐氏筛查异常、B超异常或无创产前检查（Noninvasive Prenatal Testing，NIPT）高风险等来本院产前诊断中心进行有创产前诊断，均对其进行各种产前诊断方法的介绍，填写知情同意书、自愿选择相应的检测。105位孕妇，共抽取羊水106例（1例为双胎），其中CNV-seq（102例）、核型分析（4例），所有106例样本均同时进行了QF-PCR检测。

1.2 试剂与仪器

21、18、13及性染色体非整倍体检测试剂盒（荧光PCR毛细管电泳法）购自中山大学达安基因股份有限公司以及广州市达瑞生物技术股份有限公司，甲酰胺、Liz600、ABI3500DX测序仪和Gene-Mapper5.0软件均购自美国赛默飞世尔科技有限公司，K5800微量分光光度计购自北京凯奥公司。

1.3 方法

1.3.1 羊水QF-PCR检测

在检验科分子诊断室，使用核酸提取和QF-PCR试剂盒，大体步骤如下。羊水DNA提取：取1.9mL羊水离心去上清，沉淀使用核酸提取试剂盒提取羊水基因组DNA，K5800微量分光光度计检测DNA的质量和浓度，-20℃保存；QF-PCR检测分析：前89例采用达安试剂盒（15个STR位点），后17例采用达瑞试剂盒（20个STR位点）；PCR扩增均参照对应试剂盒说明书；扩增后取1μL PCR产物和13.5μL甲酰胺、0.5μLLiz600混合，ABI3500DX进行片段分析，GeneMapper 5.0分析数据。

1.3.2 羊水CNV-seq检测

本检测抽取待检孕妇的羊水和抗凝全血交由湖南家辉遗传专科医院进行检测，参照文献中的方法[5]，大体步骤如下：提取羊水DNA，限制性内切酶水解获得平均大小为200bp的DNA片段，采用PCR-free方法制备文库（北京贝瑞和康生物技术有限公司），连接接头，在NextSeq CN500高通量测序平台，36 bp单端测序，测序深度0.1X。所有测定序列，通过平行比对软件与hg19人类基因组进行完全比对分析。以100kb为基本分析单元，将人类基因组划分为若干个连续区域，统计每个区域内样本完全匹配的uniq reads序列数。采用专用算法判读样本的CNV，根据统计结果，以标准化测序拷贝数为y轴，以每条染色体连续的100kb分析单元为x轴，绘制CNV-seq检测结果图，判断待测样本的染色体情况。通过检索CNV比对常用数据库最新公布数据进行CNV临床意义的确定[5]。

1.3.3 羊水染色体核型分析

在本院产前诊断中心，按常规方法对10mL羊水离心，取沉淀中的羊水细胞培养，制备染色体G显带，参照ISCN（2016）标准进行核型分析。

2 结果

2.1 QF-PCR与CNV-seq及染色体核型分析结果的对比

将QF-PCR测定的核型正常作为阴性，异常作为阳性，在21、18、13、X、Y共5种染色体（下文中均简称为5种染色体）的非整倍体检测方面，QF-PCR与CNV-seq和染色体核型对比，依据QF-PCR测得的核型分，结果如下：46XX QF-PCR 43例，CNV-seq符合42例，核型分析符合1例，符合率均为100%；46XY QF-PCR 49例，CNV-seq符合48例，核型分析符合1例，符合率均为100%；47XX+18 QF-PCR3例，CNV-seq符合2例，核型分析符合1例，符合率均为100%；47XY+18 QF-PCR1例，CNV-seq符合1例，符合率为100%；47XX+21QF-PCR6例，CNV-seq符合5例，核型分析符合1例，符合率均为100%；47XXY QF-PCR3例，CNV-seq符合3例，符合率为100%；47XYY QF-PCR1例，CNV-seq符合1例，符合率为100%。因此，QF-PCR与CNV-seq及核型分析的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。

2.2 CNV-seq阳性，但QF-PCR无法检出的标本统计

CNV-seq检出阳性但QF-PCR无法检出的共21例，其中，CNV多态性7例，致病性未知3例，明确致病11例，见表1。

2.3 CNV-seq检出阳性，但染色体核型无法检出的标本统计

CNV-seq检出阳性，而QF-PCR无法检出的标本共21例，其中1例2号染色体q33.1-q37.3处重复39.48Mb，染色体核型是能检测的，其余20例标本的微缺失或微重复均小于4Mb，未达到染色体核型的分辨率（5Mb），见表1。

表1 CNV检出阳性，但QF-PCR无法检出的标本统计Table1 The specimen（CNV detected positive，butQF-PCR could notdetect）statistics

3 讨论

本研究由于病例数较少，所以各种方法比较时所得的阳性符合率只能部分提示该方法的真实能力。

在本研究中，在5种染色体非整倍体检测方面，QF-PCR与CNV-seq及核型分析相比，结果完全一致，提示QF-PCR作为产前诊断项目，其准确性符合要求，这和指南及文献是一致的[3-4]。

在全部染色体检测方面，本研究中，除CNVseq多态性外，CNV-seq阳性但QF-PCR无法检出的14例标本如果未做CNV-seq，而只做QF-PCR，可能就全部漏诊了，文献也报道了类似的情况[6-7]。上述结果也部分提示产前筛查高风险的标本发生CNV-seq异常的可能性也许会更高，例如唐筛21三体阳性的孕妇在只做QF-PCR验证是否为21三体的同时，应同时选择CNV-seq或核型分析排除其他染色体的异常。

虽然核型分析是目前染色体疾病诊断的金标准之一，但其分辨率较低，为5Mb左右，因此本研究中，除了两例21三体阳性合并其他染色体微缺失的，其他18例如果只做核型分析，很可能均无法检出，而这其中，CNV-seq阳性且明确致病的有9例。此结果显示了CNV-seq较之核型分析技术的优势。

综上所述，QF-PCR技术准确性高、速度快，可大大缩短报告的等待时间，缓解孕妇及家属的焦虑情绪。但由于其局限性，在产前诊断时，需要和CNV-seq或核型分析等联合检测，这样才能更好的发挥各自的优势。CNV-seq作为覆盖面广的产前诊断，也其必须使用QF-PCR进行母体细胞污染鉴别。因此，QF-PCR和CNV-seq联合检测具有速度快、通量高、覆盖广的优势，已逐渐成为产前诊断的一线方法。