超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法测定辣椒中多种禁用着色剂

李 玮* 艾连峰 马育松 陈瑞春 郭春海

(石家庄海关技术中心河北石家庄 050051)

禁用着色剂一般为工业染料，主要用于纺织品、皮革制品及木制品的染色，但由于其廉价、着色强及稳定性强等特点，常被非法添加至食品中，长期食用含有这类物质的食品会对人们身体产生巨大的伤害，如致癌、致畸等。因此，我国已禁止此类染料以任何目的或含量在食品中出现。我国卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单》，明确禁止工业染料，如苏丹红、碱性橙Ⅱ、罗丹明B、碱性嫩黄、孔雀石绿等染料在食品中使用。面对如此多的非法滥用着色剂，由于没有快速、高通量的多种禁用着色剂筛查方法，导致了我国食品存在安全隐患。关于辣椒中多种禁用着色剂分析检测的主要方法有：高效液相色谱法[1-3]、液相色谱-串联质谱法[4-8]和高分辨质谱法[9-12]。

本实验采用乙腈和正己烷提取辣椒中的23种禁用着色剂，以QuEChERS法净化，利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)进行测定，以保留时间、一级离子质量准确度、一级离子同位素分布、二级碎片与库匹配4种手段确保准确定性分析，以TOF-MS提取离子的峰面积定量，可同时定性定量分析多种禁用着色剂，对于提高食品安全有着重要意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

TripleTOF®5600+高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪(美国，AB SCIEX)；VORTEX-2 GENE涡旋混合器(美国，Scientific)；Turbo Vap氮气吹干仪(美国，Zymark)。

23种着色剂标准品(纯度均≥95%，相关信息见表1)。单标准储备溶液：准确称取各着色剂标准品适量，用甲醇或乙酸乙酯稀释成200 μg/mL的单标储备液，使用时根据需要用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作溶液。乙腈、甲醇(色谱纯，Fluka)；甲酸、NH4Ac(色谱纯，Dikma)。实验用水均为Milli-Q(美国Millipore)高纯水。

1.2 仪器条件

色谱条件:Agilent Broshell 120 EC-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流动相A：5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸溶液+甲醇(9+1,V/V)，流动相B：0.1%甲酸甲醇。梯度洗脱程序：0～1 min，B保持5%，1～5 min，B从5%升到30%；5～9 min，B从30%升到90%；9～25 min，B保持90%；25～25.1 min，B从90%降到5%；25.1～27 min，B保持5%。流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

质谱条件:ESI和APCI复合离子源；电喷雾电离，正离子模式；电喷电压：5 500 V；离子源(gas 1)：345 kPa；离子源(gas 2)：345 kPa；气帘气：207 kPa；离子源温度：550 ℃。TOF-MS参数：去簇电压(DP)：80 V；碰撞能量(CE)：10 eV；TOF质量数扫描范围：100～1 000 Da。TOF-MS/MS参数：去簇电压(DP)：80 V；碰撞能量(CE)：35 eV；碰撞能量动态变量：15 eV；TOF质量数扫描范围：80～800 Da；高灵敏模式；信号阈值：100 cps；IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。校正方式：APCI源连接ABsciex公司自动校正系统(CDS)，每10个样品自动校正1次；APCI校正液流速：0.3 mL/min。

表1 23种禁用着色剂的分子母离子测定值、理论值和保留时间Table 1 Accurate mass measurements of molecular ions and retention times of 23prohibited dyes

1.3 提取与净化

称取粉碎均匀的样品2.00 g，置于50 mL具塞聚四氟乙烯离心管中，加入2 mL水分散混匀，再准确加入10 mL乙腈和1 g NaCl，涡旋混合1 min，振荡5 min，超声10 min，以10 000 r/min高速离心5 min后，分出上清液，重复提取一次，合并提取液，45 ℃水浴旋蒸至近干，用1.5 mL乙腈溶解，待定容。向残渣中加入10 mL正己烷，涡旋混合1 min，振荡5 min，超声20 min，10 000 r/min高速离心5 min后，取出上清液，重复提取一次，合并提取液，45 ℃水浴旋蒸至近干，用1.5 mL乙腈溶解，待定容。将2份乙腈溶解液合并，用乙腈定容至4 mL，加入500 mg无水MgSO4和100 mg C18固相分散剂，涡旋振荡2 min，高速离心5 min，取2 mL上清液于45 ℃水浴下氮吹至干，用1 mL甲醇-水(9+1)溶解残渣，经0.22 μm聚四氟乙烯过滤器过滤后，供HPLC-Q-TOF-MS测定。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的选择

23种禁用着色剂的化学性质差异较大，因此前处理方法的关键是选择提取效率好的提取溶剂，减少目标化合物在样品前处理过程中的损失，同时便于后续净化。实验考察了水、无水乙醇、甲醇、乙腈、正己烷等不同提取溶剂对目标物回收率的影响。结果表明，乙腈对于极性较强的目标化合物具有很好的提取效率，正己烷则对弱极性的苏丹红类化合物具有更好的提取效率。因此，实验采用两种不同极性溶剂共同提取的方法，即样品先经乙腈提取，再由正己烷进行二次提取。

由于目标物大多为工业染料，很容易吸附到样品上，很难被提取出来。因此，分别对提取次数、超声时间进行了比较。对加标样品分别提取1次、提取2次、提取3次和提取4次的结果进行比较，发现提取2次时的回收率较高，提取3～4次时回收率并没有明显提高。分别对10 min、20 min、30 min、40 min的超声进行了比较，发现超声20 min时目标物的回收率较高。

2.2 净化方式的选择

根据目标物的性质不同，文献中使用较多的净化手段为凝胶渗透色谱、中性氧化铝和WAX柱、C18柱、HLB柱等固相萃取柱。本实验考察了PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、Alumina-N的单种使用对目标物回收率的影响。结果表明4种吸附剂对于目标物的回收率有明显区别。当加入GCB，净化液颜色变浅，但目标物的回收率有所下降，平均回收率在10%，可能是GCB去除色素的效果明显，在去除天然色素的同时也吸附了部分目标物；Alumina-N对目标物吸附较强，只有丙酮能洗脱部分目标物，而且罗丹明B、碱性嫩黄、分散橙等回收率小于30%；PSA则对酸性染料有不同程度的吸附。然后对C18吸附剂的使用量进行考察，分别测定添加50 mg、100 mg、200 mg、500 mg、800 mg时的净化效果，随着C18使用量的增加，部分目标物的回收率有所下降，可能是较多的C18对目标物有一定的吸附。结果表明100 mg的使用量可以部分降低杂质干扰又不会影响各目标物的回收率。本实验选择C18吸附剂，其用量为100 mg。

2.3 基质效应

基质效应主要是由于基质中的共提取成分在质谱离子源中与目标化合物相互作用，从而使化合物在仪器上的响应发生增强或抑制，影响化合物的定量分析。本实验选取苏丹红Ⅰ、孔雀石绿、碱性嫩黄O、苏丹红B、酸性橙Ⅱ，通过配制标准工作曲线和基质匹配校正曲线，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作图，以基质匹配校正曲线和标准曲线斜率的比值来考察化合物的基质效应。一般认为，基质匹配校正曲线斜率与标准曲线斜率的比值在85%～115%之间不存在基质效应。结果表明，对于所选辣椒样品，基质匹配校正曲线斜率为标准曲线斜率的56%～81%，存在明显的基质抑制作用。因此，为了能较好地减小基质效应的影响，本实验采用基质匹配标准溶液进行校正。

2.4 液相色谱条件的优化

图1 23种禁用着色剂提取离子流(EIC)色谱图Fig.1 Extracted ion current chromatogram of 23 kinds target compounds

实验比较了乙腈、甲醇两种有机溶剂的分离效果，发现甲醇的分离效果较乙腈好，故选择甲醇作为有机相。实验分别在流动相中添加不同浓度的NH4Ac，观察其浓度对目标物的质谱信号影响。实验发现，NH4Ac浓度越高，大部分待测物的质谱响应信号越低。综合考虑，实验采用5 mmol/L NH4Ac溶液作为流动相。同时，在甲醇中加入0.1%甲酸，有利于目标化合物的离子化。固定流动相A为5 mmol/L NH4Ac，比较了流动相B为甲醇时添加不同浓度的甲酸(0%、0.1%、0.2%)对色谱峰的影响。结果显示，在其它已优化色谱条件下，选择含0.1%甲酸甲醇较为合适。优化条件下23种禁用着色剂标准品色谱图见图1。

2.5 质谱条件的优化

禁用着色剂中很多物质是钠盐或氯盐，对于含有Na+、Cl-的物质，由于它们在含水的流动相中容易电离，因此本研究利用仪器特有的信息相关采集(IDA)工作模式，建立TOF-MS-IDA-MS/MS工作流程，进行实验数据采集，同时获得高分辨一级质谱图和高分辨二级质谱图。

2.6 高分辨二级质谱数据库的建立

数据库收录了本实验涉及的23种化合物的分子式、相对分子质量、CAS编号、化学名及结构图等信息。对化合物标准品进行分析，每一种化合物在四个不同碰撞能量条件下得到4张二级质谱图。把着色剂的名称、分子式、精确质量数和4张不同碰撞能量的二级质谱图结合起来得到该化合物的二级质谱数据库。

2.7 方法学验证

2.7.1 线性范围和定量限在空白样品提取液中分别添加一定量的待测物，使用上述仪器条件测定后，以质量浓度对峰面积作图，得到基质匹配标准曲线。由于每个化合物的检测灵敏度存在差异，因此对线性浓度点的选择不同，23种禁用着色剂在10～500 ng/mL范围内呈线性关系，线性相关系数为0.9411～0.9989，其定量限在10～100 μg/kg之间。

2.7.2 回收率与精密度实验选取空白辣椒样品，进行3个添加水平的加标回收实验，每个添加水平平行实验8次，回收率范围为61.82%～103.25%，相对标准偏差(RSD)为2.08%～10.56%，结果见表2。

表2 辣椒中禁用着色剂线性方程、相关系数、回收率和精密度(n=8)Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r)，recoveries and precisions(RSD) of prohibited dyes in chilli(n=8)

(续表2)

CompoundLinearequationsrAdded(μg/kg)Average(μg/kg)Recovery(%)RSD(%)Dispersered1Y=17088.6+18290.1X0.969720.0016.6383.137.1350.0044.1388.266.34200.00172.5186.254.52Disperseorange3Y=26526.9+5299.67X0.988420.0016.3781.866.5950.0044.5789.133.87200.00174.8987.443.92SudanorangeGY=27.8325+5.7172X0.972410.009.1091.035.7850.0043.2586.502.90100.0088.4188.415.78DimethylyellowY=37.2800+9.4268X0.958410.008.4984.866.2350.0047.2194.439.03100.0086.5386.537.10PararedY=11.1017+330.6706X0.978720.0019.0195.073.3050.0046.2792.553.93200.00191.7995.905.60Citrusred2Y=2486.556+1332.3416X0.968510.008.9589.542.7550.0048.8797.748.24100.0086.9086.905.70SudanredGY=1179.3877+540.1667X0.941110.009.8498.392.4250.0050.20100.405.46100.0095.4795.472.41SudanⅠY=2925.87+1968.21X0.999410.0010.00100.043.5350.0049.1698.329.65100.0096.4296.422.08SudanⅡY=6751.66+7151.217X0.998110.009.7697.605.6250.0049.2898.556.26100.0092.1292.127.44SudanⅢY=354.493+575.536X0.988510.009.8098.033.0150.0048.0096.006.83100.0099.1499.143.77SudanⅣY=108.216+571.656X0.947620.0017.7188.563.3250.0043.1186.225.11200.00179.4889.742.31SudanredBY=256.156+592.162X0.993620.0018.4292.083.6350.0051.63103.255.26200.00194.9997.504.31Sudanred7BY=737.828+432.984X0.947510.008.8188.133.4250.0045.1490.284.42100.0090.6590.652.38

3 结论

本方法采用改进的前处理方法提取辣椒中的23种禁用着色剂，利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱进行测定，获得了满意的回收率，良好的线性关系和精密度。该方法具有快速、灵敏、准确和高通量等优点，可用于实际工作中日常检测。