新生儿脆性X综合征筛查对本地区CGG重复数情况分析

马会卿 郝秀双 刘晓玲 郭志娟 杨灵敏

脆性X综合征是一种X染色体连锁不完全显性遗传疾病(据估计外显率为：男79%，女35%[1])，新生儿发病率0.4‰～0.67‰，占所有X连锁智力低下疾病的15%～25%，其发病率仅次于唐氏综合征[2]。是引起自闭症障碍和遗传性智力障碍最常见的单基因疾病，可表现为多动症及不同的神经性退化[3]。可以根据CGG重复数划分FMR1基因的不同类型：正常型为5～44个重复，以29，30个重复最为常见[4,5]；45～54个重复为中间型，又称灰区，一般来说，此基因型携带者表型正常，但其后代可能发生重复单元数量变异；55～200个重复为前突变，此时CGG重复数变得很不稳定，在母亲和孩子间易于发生变异，且携带者有几率表现出临床症状，如脆性X相关原发性卵巢功能不全及共济失调综合征；若CGG重复数大于200，常伴有FMR1基因异常甲基化，携带者表现为脆性X综合征[5]。为有效控制脆性X综合征的发病率，进行产前筛查及新生儿筛查是十分关键的措施。本文采用了PCR全长扩增与重复引物PCR扩增相结合的方法，以提高新生儿筛查准确性。共筛查992名新生儿，其中野生型984例，中间型1例，全突变男性1例。

1 资料与方法

1.1 一般资料 此科研项目通过了伦理委员会审查。并经家属知情同意后，我院对2017年6月至2018年2月出生的新生儿随机采集脐带血以进行脆性X综合征筛查，共检测992例新生儿，其中男546例，女446例。

1.2 研究对象与样本采集 在充分告知父母该项研究的性质、目的、内容、可预期的风险和影响等知情同意后采集样本。新生儿筛查中采集新生儿的脐带血。胎儿娩出后结扎脐带，胎盘娩出后，由接生者在胎盘侧近断脐端的脐带作为进针点，进针前先用消毒纱布擦干其表面，酒精消毒，然后抽脐静脉血2 ml平均滴在两个血斑上，待其自然风干后封存。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取:按照厂家说明书步骤，使用QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德国)提取所采集血液样本；使用NanoDropTM(Thermo Fisher,美国)进行定量，根据检测结果稀释DNA样本至50 ng/μl，保存于4℃待用。

1.3.2 PCR扩增:使用FMR1基因CGG重复数检测试剂盒(北京阅微基因，中国)对DNA样本进行检测。每个检验包含全长扩增和重复扩增两个体系，体系配制及PCR设置遵循厂家说明书。使用ABI VeritiTM96-Well PCR仪(Applied Biosystems,美国)进行PCR扩增。

1.3.3 毛细管电泳及结果判读:电泳每个体系包括上述PCR产物1 μl,分子量内标QD1200 0.3 μl，Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems,美国)8.7 μl，共计10 μl。使用50 cm POP-7TM胶于ABI 3500XL DX遗传分析仪(Applied Biosystems,美国)进行电泳分离。使用GeneMapper v5.0软件进行分型分析，分析阈值设定为50 RFU。结果判读标准遵循厂家说明书，全长体系和重复扩增体系可分别计算样本CGG重复数，按说明书规定的方法综合两者体系的重复数读数得出最终的CGG重复数结果。

2 结果

2.1 新生儿脆性X综合征筛查情况 992例新生儿筛查中一次成功检出986例，一次检出率达99.4%。共检出野生型984例，中间型1名、全突变1例，三种类型的基因突变图谱如图1所示。其中，全突变患者的CGG重复数大于200个，经随访发现确为来自脆性X综合征家系的1例男性患者。见图1。

图1 (a)野生型(CGG重复数为28);(b)中间型(CGG重复数为29和50);(c)全突变(CGG重复数>200)

2.2 CGG重复数分布情况 986例检出FMR1基因CGG重复数分布，共检出28种CGG重复数，其中CGG重复数在13～44范围内的均为正常型。正常型的CGG重复数占比图如图2所示，正常型的CGG重复数主要集中在29、30个重复，占全部样本约78.2%，这与先前文献报道一致；本研究还发现36个CGG重复是除29、30个重复外最常见的基因型，占全部样本的约8.74%。另外，本文采用Fisher精确检验的方法分析男性和女性之间CGG重复数的差异，发现无显著差异(P=0.415)，表明CGG重复数的分布情况与性别无关。见表1，图2。

表1 986名新生儿筛查CGG重复数分布情况 例(%)

3 讨论

脆性X综合征发病率仅次于唐氏综合征，因此进行大规模的产前及新生儿筛查很有必要。目前已有多种方法可以用于检测脆性X综合征，如Southern blot[6-9]、PCR法检测甲基化[10]、PCR法检测CGG重复序列长度[11]及重复引物PCR法[12](Repeat Primer PCR,RP-PCR)。但是以往的检测方法存在样本采集运输困难，检测时间长，通量低等各种缺陷。因此，建立一个简便准确的筛查方法尤为重要。本研究结合CGG重复全长PCR检测和重复引物检测这两种方法计算样本的CGG重复数，可提高检测的灵敏度并实现了CGG重复数的准确判读。此检测体系样本采集运输简便稳定，操作简单，检测准确，适合用于新生儿脆性X综合征的大规模区域性筛查。

图2 正常型CGG重复数占比图

我院基于该方法对近千例新生儿进行了脆性X综合征筛查，结果表明其FMR1基因CGG重复数分布情况与以往报道相似[12]。在正常人群中，除最为普遍、常见的29、30个重复外，我们还观察到了相对高频(8.7%)的36个CGG重复。相对高频的36CGG重复并非来自随机突变，而是产生于人群亚结构。Chen等[13]最早报道了中国人群中的相对高频的36CGG重复数现象，并通过测序确认其与一种9A9A6A9的CGG-AGG排布模式相关。后续基于其他东亚、东南亚人群的脆性X综合征调查发现了相似的高频36CGG重复数[14]，揭示了这一特殊重复数在东部亚洲人群中广泛存在。而基于非亚洲人群的调查中没有发现类似的高频36CGG重复基因型[13,15,16]。通过SNP分析，研究者认为36CGG重复是与亚洲特有的单倍群高度相关的，这与本研究的结果相符。

此外，我们发现了一例脆性X综合征患儿，其FMR1基因的CGG重复数>200，该患儿男性，孕足月出生，出生时体重2 700 g，大耳朵，余未见明显异常，通过进一步对其家系的检查，我们确认了该患儿来自一个脆性X综合征家系，已经在该家系中至少传递了三代人。脆性X综合征目前无法治愈，因存在中重度的智力障碍，对整个家庭及社会造成严重、长期的影响；且脆性X综合征可以在家系中扩大，如果不加以管理，该家系后代中患病人数增加，为了预防患儿出生,应行婚前或孕前检查脆性 X 染色体,诊断携带者的高危人群,以便有的放矢进行产前诊断,避免患儿出生。 脆性 X 染色体阳性者应做家系调查,发现杂合子进行遗传咨询和产前诊断。确诊脆性 X 染色体阳性男胎儿应终止妊娠,如杂合子的女胎儿,则可能为脆性X 染色体携带者或者是轻度智力低下的患者[17]。这进一步说明了加强基层脆性X综合征宣传和加大筛查力度、倡导优生优育的重要性。

综上所述，通过全长扩增结合重复引物扩增的方法可以有效、准确检测出FMR1基因CGG重复数，并且此检测体系操作较为简便，适合用于新生儿脆性X综合征的大规模筛查，最终达到优生优育的目。