CME术后DC-CIK联合奥沙利铂、卡培他滨治疗结肠癌对血清HER2和APE1自身抗体水平的作用

李国华 张成建 艾万朝 张军翔

结肠癌是最常见的消化道恶性疾病之一，直肠与乙状结肠交界处为其常见的发病部位[1]；治疗主要包括手术及辅助放化疗[2]，但由于其早期症状不典型，确诊时常常已是中晚期，同时术后转移及复发率也是影响患者预后的重要因素[3]。完整结肠系膜切除(complete mesocolic excision,CME)手术是结肠癌规范化手术项目，要求完整切除病灶以及最大程度清扫淋巴结，研究表明其可明显提高结肠癌患者生存率[4]。奥沙利铂联合卡培他滨是目前结肠癌的一线化疗方案，研究表明其治疗结肠直癌疗效明确，安全性高[5]。免疫治疗是近几年较为热门的肿瘤治疗新兴方法，主要包括细胞免疫治疗、肿瘤疫苗及小分子药物等[6]，其中树突状细胞-细胞因子诱导杀伤细胞(dendritic cell-cytokine induced killer,DC-CIK)是通过体外激活肿瘤抗原特异性的DC-CIK免疫细胞，回输至患者体内发挥抗肿瘤细胞作用[7]。同时，结肠癌的早期诊断及预后判断对患者生存状况有重要意义，人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)及APE1自身抗体(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 autoantibodies，APE1-AAbs)是近年研究较多的结肠癌诊断因子[8,9]，并与病情程度密切相关。本试验旨在探讨CME术后DC-CIK细胞免疫治疗联合奥沙利铂、卡培他滨治疗结肠癌对血清HER2和APE1自身抗体水平的作用，以明确其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2014年9月至2016年7月在我院就诊的82例结肠癌CME术后患者为研究对象，按随机数字表法分成对照组(n=41)和试验组(n=41)。对照组中，男18例，女23例；平均年龄(54.33±6.28)岁；分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期31例；病理类型：腺癌28例，粘液癌10例，未分化癌3例。试验组中，男19例，女22例；平均年龄(55.42±6.19)岁；分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期32例；病理类型：腺癌30例，粘液癌9例，未分化癌2例。2组性别比、年龄、分型等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。2组患者治疗由同一组具有结肠癌治疗经验的医师施行。本研究在试验前已由医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：年龄>18岁；经病理检查符合结肠癌诊断标准[10]；首次行CME且术前未接受过放化疗。

1.2.2 排除标准：结肠癌伴远处转移；对化疗耐受差；预期寿命<3个月；合并其他肿瘤患者；合并心、肝、肾等系统疾病；对本研究药物过敏者；拒绝签署知情同意书。

1.3 治疗方法 对照组采用奥沙利铂(江苏恒瑞医药公司，规格：100 ml∶0.1 g)剂量130 mg/m2，溶于5%葡萄糖溶液(河南华利药业有限责任公司，规格：500 ml∶25 g)500 ml中，缓慢静脉滴注3 h，第1天；卡培他滨片(上海罗氏制药公司，规格：0.5 g/12片)治疗，1 g/m2，口服，早晚各1次，第1～14天，完成1个周期化疗(共4周)，完成6个周期治疗。试验组在对照组的基础上，分别在化疗开始前、化疗3周及6周期后各行DC-CIK细胞免疫治疗1个周期，将制备完成的DC于腹股沟淋巴结处皮下注射，每周期3次共注入(3～5)×108个细胞，同时将制备完成的CIK行静脉输注，1次/d，每次完成输注后行IL-2注射液100万单位静脉滴注，每周期5次共输注5×109个细胞。

1.4 DC-CIK细胞制备方法 (1)患者全肿瘤抗原制备：取患者肿瘤组织标本大小1 cm×1 cm×0.5 cm，取材不可包含坏死及正常组织，庆大霉素溶液冲洗3次后置于8万U庆大霉素溶液浸泡，-80℃冻存；37℃水浴箱复温1640培养基冲洗3次后剪碎组织在200目网塞上研磨，1640培养基冲洗留冲洗液-80℃冻存，37℃水浴箱复温，1 500 r/min离心15 min，留取上清液即为患者全肿瘤抗原，核对患者编号，-80℃冻存备用。(2)DC肿瘤疫苗及CIK制备：予患者注射200 μg 重组人粒细胞刺激因子，24 h后抽取外周血100 ml，肝素管抗凝，Ficoll梯度离心法分离单个核细胞，用1640培养基冲洗3次后将分离所得细胞悬浮于1640培养基中，细胞浓度2×106个/ml，置于37℃、2%CO2培养箱中培养4 h，贴壁细胞即为DC，悬浮细胞即为CIK。将细胞悬浮液吸出作为CIK培养，将DC加入DC培养基培养(含庆大霉素40 U/ml，白细胞介素420 ng/ml，粒单细胞集落刺激因子50 ng/ml)，每48小时换液，培养第6天加入患者全肿瘤抗原及RH-TNF 15 ng/ml，孵育1 d，即得DC肿瘤疫苗，0.9%氯化钠溶液洗涤，抽取小部分混入CIK培养，剩余配入1%人血白蛋白制成DC肿瘤疫苗(2 ml/支)；CIK培养(含γ-干扰素1 000 U/ml，IL-2 500 U/ml)，37℃、5%CO2培养箱中孵育1 d，加入抗CD3单抗100 μg/ml和IL-15 10 U/ml,每72小时更换培养液，保持细胞浓度2×106个/ml，10 d后取细胞液行流式分析，确认无微生物污染，0.9%氯化钠溶液冲洗3次，配入1%人血白蛋白制成DC-CIK细胞液(200 ml/袋)。

1.5 观察指标

1.5.1 临床疗效：分别于治疗前、治疗后2周、治疗后2年抽取患者3 ml外周静脉血，赛默飞离心机以3 000 r/min速度离心10 min，取血清冷冻保存待检(-20℃保存)，使用人CEA酶联免疫检测试剂盒(上海信裕公司产，操作严格参照说明书)测定CEA数值。治疗期间及治疗后2年内定期随访(包括血常规、肿瘤标志物、结肠镜、腹部B超及CT，必要时行PET检测)，评估复发及转移情况，记录2组患者2年肿瘤复发率。

1.5.3 血清HER2及APE1-AAbs水平：分别于治疗前、治疗后2周、治疗后2年抽取患者3 ml外周静脉血，赛默飞离心机以3 000 r/min速度离心10 min，取血清冷冻保存待检(-20℃保存)，使用HER2酶联免疫检测试剂盒(上海仁捷科技有限公司产，操作严格参照说明书)，APE1-AAbs酶联免疫检测试剂盒(上海江莱生物科技公司产，操作严格参照说明书)测定血清HER2及APE1-AAbs水平。

1.5.4 不良反应：记录治疗过程中发生的不良事件，评价治疗安全性。

2 结果

2.1 2组患者临床疗效比较 治疗前，2组CEA水平差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后2周，2组CEA水平明显降低(P<0.05)，试验组明显低于对照组(P<0.05)；治疗后2年，2组CEA水平较治疗后2周明显升高，且对照组显著高于试验组(P<0.05)，且2组间不同时间点及组间时间点交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗2年后，试验组及对照组2年肿瘤复发率分别为9.76%、26.83%，试验组明显低于对照组(P<0.05)。见表1、2。

组别CEA治疗前治疗后2周治疗后2年对照组20.71±10.744.27±2.14∗10.27±4.73#试验组21.25±11.093.14±2.10∗△5.70±3.52#△组间F=2.320,P=0.020不同时间点F=2.830,P=0.005组间∗不同时间点F=3.532,P=0.000

注：与治疗前比较，*P<0.05；与治疗后2周比较，#P<0.05；与对照组比较，△P<0.05

表2 2组2年肿瘤复发率比较 n=41，例

2.3 2组患者血清HER2及APE1-AAbs水平比较 治疗前，2组患者HER2及APE1-AAbs表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，2组血清HER2及APE1-AAbs水平较治疗前均明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)，且试验组显著低于对照组(P<0.05)，治疗2年后，2组血清HER2及APE1-AAbs水平均较前升高，且对照组显著高于试验组(P<0.05)，且2组间不同时间点及组间时间点交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.4 2组患者不良反应情况比较 治疗过程中，试验组出现注射部位皮损2例，发热5例，均经对症处理后12 h内出现好转；2组患者在骨髓抑制、消化道症状(如恶心、呕吐及腹泻)、外周神经损伤及手足综合征等不良反应方面呈现明显差异，且试验组明显低于对照组(P<0.05)。见表5。

注：与治疗前比较，*P<0.05；与治疗后2周比较，#P<0.05；与对照组比较，△P<0.05

组别HER2(mg/L)治疗前治疗后2周治疗后2年APE1-AAbs(ng/L)治疗前治疗后2周治疗后2年对照组20.46±4.678.82±3.27∗14.32±8.13#10.87±2.706.37±2.18∗9.54±8.17#试验组18.78±4.825.27±4.15∗△7.79±5.28#△11.12±3.044.72±2.53∗△5.70±6.22#△组间F=9.350,P=0.000F=11.470,P=0.000不同时间点F=5.970,P=0.000F=7.030,P=0.000组间∗不同时间点F=7.430,P=0.000F=9.400,P=0.000

注：与治疗前比较，*P<0.05；与治疗后2周比较，#P<0.05；与对照组比较，△P<0.05

表5 2组不良反应率比较 n=41，例(%)

3 讨论

结肠癌主要病理类型包括腺癌、粘液腺癌及未分化癌等，中晚期结肠癌治疗难度大，存在对化疗不敏感情况，术后易复发转移[11]。DC-CIK免疫治疗是近几年肿瘤治疗方面的热点，通过调节肿瘤免疫机制产生抗肿瘤作用，研究表明其在结肠癌辅助治疗中可提高患者免疫功能[12]。在结肠癌早期诊及病情判断方面研究也不断深入[13]，HER2及APE1-AAbs是与肿瘤免疫相关的因子，研究表明其与结肠癌病情预后相关[14]。本试验旨在探究CME术后 DC-CIK细胞免疫治疗联合奥沙利铂、卡培他滨对结肠癌血清HER2和APE1-AAbs水平的作用，以明确其临床应用价值。

HER2属于酪氨酸激酶活性蛋白，与细胞增殖分化、血管生成等过程密切相关，研究证明其高表达导致细胞增殖分化失控，促进细胞恶性转化及肿瘤转移，研究发现HER2可作为多种肿瘤如结肠癌的诊断及预后评价指标[8]。APE1是一种DNA损伤修复蛋白，参与DNA损伤修复及多种转录因子如P53等的调控；结肠癌患者APE1异常表达刺激机体产生APE1-AAbs，APE1-AAbs可作为结肠癌辅助诊断因子[19]。本试验结果表明，治疗2周后，2组血清HER2及APE1-AAbs水平较治疗前均明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)，且试验组显著低于对照组(P<0.05)，治疗2年后，2组血清HER2及APE1-AAbs水平均较前升高，且对照组显著高于试验组(P<0.05)；分析其可能原因，DC-CIK细胞免疫治疗联合奥沙利铂、卡培他滨治疗采用一线化疗方案与DC-CIK免疫治疗联合，可在化疗方案控制肿瘤病情基础上引入免疫细胞，增强患者免疫功能，调节患者肿瘤免疫失衡状态，试验结果表明治疗后负性Treg细胞对照组明显高于试验组，DC-CIK细胞免疫治疗调节了肿瘤组织抑制的免疫微环境，发挥更好的抗肿瘤作用，降低了肿瘤负荷，降低了降低结肠癌患者的血清HER2和血清APE1自身抗体水平。王铁等[20]研究表明，DC-CIK细胞免疫治疗联合奥沙利铂、卡培他滨治疗结肠癌可降低CEA水平，控制肿瘤复发并调节肿瘤免疫，改善患者生存状态，结果与本研究相符。

在药物安全性及不良反应方面，试验组在骨髓抑制、消化道症状(如恶心、呕吐及腹泻)、外周神经损伤及手足综合征等不良反应方面呈现明显明显低于对照组，说明DC-CIK细胞免疫治疗联合奥沙利铂、卡培他滨治疗在结肠癌治疗中安全性好，耐受度较好。

综上所述，CME术后 DC-CIK细胞免疫治疗联合奥沙利铂、卡培他滨可提高结肠癌患者的疗效，改善机体免疫功能,降低结肠癌患者的血清HER2和APE1-AAbs水平。