IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘易感性的关系

刘亚昆 韩英俊 张志伟 马亚楠

哮喘是一种由多种细胞因子参与的慢性气道炎症性疾病，儿童哮喘患病率逐年上升且严重影响儿童生长发育[1]。哮喘的主要病理特征为气道炎症与气道重塑，体内慢性炎症可促进气道高反应性进而促使儿童呼吸困难[2]。哮喘发生及发展过程受多种基因及环境因素调控，研究显示基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与儿童哮喘因感性密切相关[3]。因而探讨儿童哮喘与基因SNP的关系进一步揭示其发病机制对防治哮喘发生具有重要意义。白细胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)是一种由辅助性T细胞17(Th17)产生的细胞因子，其可在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞中表达并可调节免疫反应及炎性反应，研究显示哮喘患者血清IL-17A水平明显升高并可通过诱导、激活中性粒细胞募集于呼吸道进而参与哮喘发生及发展过程[4]。研究表明IL-17A基因rs2275913位点SNP与肺结核易感性有关，突变基因型AA可增加肺结核易感性发生风险[5]。关于IL-17A基因rs2275913位点SNP与儿童哮喘易感性的研究相对较少，因此本研究主要探讨IL-17A rs2275913位点多态性与儿童哮喘易感性的关系，以期为个体化治疗及预防儿童哮喘提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月至2018年5月本院收治的支气管哮喘儿童98例为哮喘组，所有患儿符合支气管哮喘诊断标准[6]，其中男59例，女39例；年龄1～6岁，平均(4.12±1.25)岁。同时选取同期健康体检儿童70例为对照组，其中男37例，女33例；年龄1～5岁，平均(3.86±1.17)岁。2组患儿年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，患儿家属知情且签署同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：对照组儿童近期无发烧、过敏及感染等病症；哮喘患儿未服用激素类药物；对照组儿童未有过敏性鼻炎等过敏性疾病。排除标准：合并自身免疫性疾病患儿。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取与引物合成：分别采集2组儿童外周静脉血2 ml，置于抗凝试管内，采用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因组DNA，IL-17基因rs2275913位点正向引物序列为5’-GCATAACTCTTCTGGCAGCTGTA-3’，反向引物序列为5’-TGCCCACGGTCCAGAAATA C-3’，延伸引物序列为5’-TTTTTCCCAATGAGGTCATAGAAGAATCTCT-3’，引物由上海英潍捷基生物公司设计合成。

1.3.2 采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度(PCR-RFLP)检测IL-17 rs2275913基因多态性:采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度(PCR-RFLP)检测IL-17 rs2 275 913基因多态性，PCR目的片段扩增反应体系共25 L，2×Taq PCR MasterMix(北京中科瑞泰生物科技有限公司)12.5 L，正反向引物各0.8 L，DNA样本2 L，ddH2O 8.9 L。置于Eppendorf聚合酶链反应PCR仪(德国艾本德公司)进行PCR反应，程序设定：94℃ 5 min；95℃ 30 s；59℃ 40 s；72℃ 30 s，共35个循环，72℃终延伸5min。采用琼脂糖凝胶电泳反应检测PCR反应产物以判断扩增结果，取PCR反应产物进行PCR-RFLP检测，限制性内切酶XMNI购自美国Fermentas公司，配制酶切体系共15 L：5 L PCR产物，限制性内切酶XMNI 0.5 L，10×FastDigest Green Buffer(北京索莱宝科技有限公司)1 L，ddH2O 8.5 L。37℃恒温水浴锅内反应5 min，65℃恒温水浴锅内反应5 min，采用琼脂糖凝胶电泳反应检测酶切结果，其中BeckmanDU640型核酸蛋白分析仪购自美国Beckman公司。运用BOX凝胶成像系统(美国ThermoFisher公司)鉴定，采用ABI 3730XL测序仪(天津金思德生物技术有限公司)与GeneMapper4.0软件(美国ThermoFisher公司)进行序列测定确定基因分型。

1.3.3 结果判定:根据电泳条带确定IL-17 rs2275913基因多态性：野生型纯合子GG型，两条DNA条带，246 bp、122 bp；突变杂合子GA型，三条DNA条带，368 bp、246 bp、122 bp；突变纯合子AA型，一条DNA条带，368 bp。

1.3.4 哮喘相关性指标检测:采集哮喘患儿外周血2 ml置于EP试管内，取1 ml血液样本采用化学发光法检测总免疫球蛋白E(IgE)水平，检测试剂盒购自武汉明德生物科技股份有限公司；采用流式细胞术检测嗜酸性粒细胞比例。1 ml血液样本放入离心机内离心(3 000 r/min 20 min)，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测人软骨糖蛋白39(YKL-40)水平，检测试剂盒购自合肥莱尔生物科技有限公司。分别采集哮喘患儿空腹静脉血5 ml置于EDTA试管内，以3 000 r/min转速离心15 min，吸取上清液于另一试管内，置于-80℃超低温冰箱内保存，采用ELISA法检测血清IL-17、白细胞介素-4(IL-4)水平，检测试剂盒均购自美国RapidBio Lab公司。

2 结果

2.1 IL-17A rs2275913基因多态性检测结果 IL-17A rs2275913位点存在单核苷酸多态性，分别为野生型纯合子GG型、突变杂合子GA型、突变纯合子AA型，测序验证准确率为100%。见图1。

2.2 Hardy-weinberg遗传平衡验证 对照组与哮喘组IL-17A rs2275913位点基因型频率实际值与预测值对比，差异均无统计学意义(P>0.05)，其基因型频率稳定，符合Hardy-weinberg平衡定律。见表1。

图1 IL-17A rs2275913 G/A位点PCR产物酶切后电泳图

表1 IL-17A rs2275913基因型频率实际值与预测值比较 例(%)

2.3 2组基因型频率比较 IL-17A rs2275913位点基因型频率在对照组、哮喘组间分布对比，差异有统计学意义(P<0.05)，且哮喘组A等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组基因型频率对比分析 例(%)

2.4 IL-17A rs2275913基因多态性对哮喘指标水平的影响 哮喘组患儿血浆YKL-40浓度、IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒细胞比例在IL-17A rs2275913位点不同基因型中差异均统计学意义(P<0.05)，GA、AA基因型哮喘患儿血浆YKL-40浓度、IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒细胞比例均显著高于GG基因型患儿(P<0.05)。见表3。

基因型IL-4(pg/L)IgE(mg/L)YKL-40浓度(ng/ml)嗜酸性粒细胞比例(%)IL-17(ng/L)GG(n=16)86.31±14.5815.53±5.3156.41±12.811.41±0.2235.21±11.25GA(n=52)95.47±15.27∗18.76±4.71∗65.27±16.14∗1.67±0.17∗45.67±10.24∗AA(n=30)110.37±18.38∗20.36±5.19∗70.24±13.16∗1.88±0.14∗68.31±16.78∗F值13.5224.9544.56640.45844.550P值<0.010.0090.013<0.01<0.01

注：与GG基因型比较，*P<0.05

2.5 IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘易感性的关系 以GG基因型为参照比较IL-17A rs2275913位点突变杂合基因型GA、突变纯合基因型AA与儿童哮喘易感性的关系，Logistic回归分析法矫正患儿年龄、病程、性别等多因素后，结果显示携带AA基因型与携带A等位基因儿童患哮喘的风险分别是携带GG基因型儿童的2.260倍、2.085倍。见表4。

表4 IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘易感性的关系

3 讨论

哮喘是由多基因调控的遗传病，而免疫功能紊乱是其主要发病机制，研究表明个体内Th1/Th2比例偏向Th2细胞导致Th1细胞功能受到抑制从而导致儿童哮喘发生及发展[6,7]。因此，从分子生物学的角度阐明儿童哮喘的病因和病理，发现与儿童哮喘有关的致病基因有助于儿童哮喘的预防及治疗。

IL-17是Th17细胞的效应因子，其可通过诱导组织发生炎症反应进而参与哮喘等疾病的发生及发展过程[8]。IL-17可通过促进或刺激树突状细胞等产生炎性介质或趋化细胞因子进而引发炎性反应，同时其还可激活巨噬细胞、上皮细胞等促使其释放白细胞介素-1(IL-1)等炎性细胞因子进而引发气道炎症反应及气道重构[9]。研究表明IL-17A基因单核苷酸多态性与自身免疫性疾病等多种疾病发生密切相关，IL-17A rs2275913位点G等位基因突变为A等位基因进而影响蛋白质表达水平导致遗传易感性[10,11]。IL-17A rs2275913基因位点A等位基因携带者可增加胃癌发生风险，还可增加丙型肝炎病毒感染所致肝损伤发生风险，同时还与病毒性心肌炎患者心肌损伤程度有关[12-14]。关于IL-17A rs2275913基因位点多态性与儿童哮喘的研究相对较少，本研究结果显示哮喘组与对照组儿童IL-17A rs2275913基因位点均存在单核苷酸多态性即G→A，野生基因型为GG、杂合基因型GA、突变纯合基因型AA，且2组IL-17A rs2275913基因位点各基因型频率均符合Hardy-weinberg平衡定律，同时IL-17A rs2275913位点基因型频率在对照组、哮喘组间分布对比差异有统计学意义，且哮喘组A等位基因频率高于对照组，说明IL-17A rs2275913位点A等位基因频率升高可能引发儿童哮喘。提示IL-17A rs2275913位点基因多态性与儿童易感性有关，可能为儿童哮喘易感基因。

IL-17A rs2275913位点野生型等位基因G突变为A后可增强其基因转录活性并激活其基因表达进而促进IL-17合成及分泌导致AA基因型携带者血清IL-17水平升高[15,16]。本研究分析儿童哮喘IL-17A rs2275913位点多态性可知哮喘组突变基因型GA+AA患儿比例高于对照组，而GG基因型低于对照组，由此推测IL-17A rs2275913位点G→A后IL-17A基因转录活性增强并提高IL-17水平进而介导气道炎症反应。研究表明哮喘患者血清IL-4、IL-17水平明显身高并可促进IgE合成，而IgE含量与哮喘患者气道高反应性高度呈正相关[17]。本研究结果显示哮喘组患儿血清IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒细胞比例在IL-17A rs2275913位点不同基因型中差异均具统计学意义，GA、AA基因型哮喘患儿IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒细胞比例均高于GG基因型，说明携带AA基因型儿童气道高反应性有关，提示IL-17A rs2275913位点多态性与气道高反应性密切相关。YKL-40属于几丁质酶样蛋白并可水解几丁质聚合物，研究表明YKL-40可通过激活呼吸道上皮细胞蛋白酶活化受体2进而参与哮喘发生及发展过程[18]。本研究结果显示GA、AA基因型哮喘患儿YKL-40浓度高于GG基因型，说明携带AA基因型哮喘患儿伴随相对较高的YKL-40浓度，而携带GG基因型患儿与之相反。提示儿童群体中IL-17A rs2275913位点A等位基因是哮喘的易感因子，而G等位基因可能对哮喘发挥保护作用。同时本研究采用Logistic回归分析法分析IL-17A rs2275913基因多态性与儿童哮喘易感性的关系，结果显示携带AA基因型与携带A等位基因儿童患哮喘易感风险分别是携带GG基因型儿童的2.260倍、2.085倍，提示携带AA基因型的儿童极易产生哮喘易感性。

综上所述，IL-17A基因rs2275913位点多态性与儿童易感性有关，AA基因型携带者极易发生哮喘，可能作为防治儿童哮喘的候选基因进而为儿童哮喘早期预防及个体化治疗提供依据。然而，不同地区儿童基因多态性分布频率不同导致患儿易感性不同，因而仍需扩大样本量对不同地区儿童进行研究，以期揭示IL-17A基因rs2275913位点多态性与儿童哮喘易感性的内在作用机制。