慢病毒介导的c-Myc启动子结合蛋白1 过表达对结肠癌HCT116细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在我国的发病率和死亡率有明显升高的趋势，严重威胁着人们的身体健康和生活质量[1]。目前，结肠癌常用的手术治疗有一定的局限性，而常用的放化疗又有一定的毒副作用。随着医学水平的不断提高，靶向基因治疗成为近年来研究的热点[2-4]。肿瘤细胞的恶性增殖和凋亡异常是导致肿瘤发生的重要机制，深入研究结肠癌细胞增殖和凋亡的分子机制，寻找有效的治疗靶点对结肠癌的治疗具有重要作用。

c-Myc是一种研究较为广泛的癌基因，在结肠癌中异常高表达，可通过调控人类15﹪基因影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡等过程，与结肠癌的发生发展密切相关[5-8]。c-Myc启动子结合蛋白1（c-Mycpromoter binding protein 1，MBP-1）是细胞核内的一种调节因子，可通过与c-Myc的P2 启动子特异性结合抑制c-Myc表达，进而影响肿瘤发生发展[9]。近年来有研究发现，MBP-1在结肠癌组织中异常低表达，但其在结肠癌发生发展中的作用尚不清楚[10]。本研究通过慢病毒介导MBP-1过表达，观察其对结肠癌HCT116细胞增殖及细胞周期的影响及其机制，旨在从分子水平上揭示MBP-1 调控结肠癌发展的机制，为结肠癌的靶向治疗提供新靶点。

材料与方法

一、材料

1.主要试剂：人结肠癌细胞株HCT116（美国ATCC）；胰酶、胎牛血清和DMEM 培养基（美国Gibco公司）；青霉素-链霉素溶液、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（上海碧云天公司）；CCK-8 试剂、PCR 试剂盒和第一链cDNA 合成试剂盒（上海生工生物公司）；鼠抗MBP-1 单克隆抗体、Trizol 总RNA 提取试剂盒（晶美生物公司）；兔抗NF-κB p65 单克隆抗体（美国Cell Signaling公司）；二抗羊抗鼠或抗兔（北京中杉公司）；MBP-1过表达的重组慢病毒颗粒（LV-MBP-1-GFP）和空载体对照慢病毒颗粒（LV- GFP）由上海吉凯生物公司构建并合成。

二、方法

1.细胞培养、分组及病毒转染：采用含10﹪胎牛血清的DMEM 培养基在5﹪CO2、饱和湿度和37℃恒温细胞培养箱中常规培养HCT116 细胞。将体外培养的HCT116细胞用空载感染、对照慢病毒感染和MBP-1过表达慢病毒感染进行处理。取生长良好的对数生长期细胞，以每孔5×105个细胞接种至6孔细胞板上。培养箱中培养细胞约70﹪汇合率时，采用流式分选技术获取稳定表达的HCT116细胞株。

2.RT-PCR 检测：收集待测的HCT116细胞，参照Trizol 总RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA，并将RNA 反转录合成cDNA。根据上海生工生物设计的内参β-actin 引物（表1）参照PCR 试剂盒步骤进行PCR 扩增，采用2-ΔΔCT法计算MBP-1 mRNA的相对表达量。其中，20 μl反应体系：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl、Master Mix 10 μl和ddH2O 6 μl；反应条件：94℃预变性60 s，94℃变性45 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，30个循环。重复检测3次。

表1 引物序列表

3.Western blot 检测：收集待测的HCT116细胞，加RIPA细胞裂解液于冰上裂解提取总蛋白，BCA 法检测总蛋白浓度后，行SDS-PAGE 电泳，每条泳道的上样量为60 μg，每个样品设3个重复。转至PVDF 膜后，以封闭液（含50 g/L 脱脂奶粉）封闭2 h。特异性一抗（1:800）4℃下孵育过夜，以辣根过氧化物酶标记的二抗（1:2 000）37℃孵育2 h。经化学发光剂暗室内显影曝光后，Quantity One 4.6.2软件分析MBP-1、NF-κB p65、c-Myc和CyclinD1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达水平。

4.CCK-8 法检测细胞增殖：收集细胞，调整细胞浓度为4×105个/ml。以每孔100 μl细胞悬液平铺于96孔细胞板上，培养箱中常规培养24、48、72 h后，以10 μl CCK-8处理4 h。酶标仪检测HCT116细胞在570 nm 波长处的吸光度（OD）值。实验重复3次，取平均值纳入统计。

5.流式细胞仪检测细胞周期：收集细胞，经磷酸缓冲液洗涤后，调整细胞浓度为3×105个/ml。参照细胞周期检测试剂盒说明书步骤检查各组HCT116细胞的周期变化情况。

三、统计学分析方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，MBP-1表达水平、OD 值、细胞周期、凋亡蛋白、NF-κB信号通路相关蛋白表达均以±s表示，三组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用F检验，若方差齐则组间比较采用LSD检验，若方差不齐则组间比较采用Dunnett检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、LV-MBP-1-GFP 感染使结肠癌HCT-116细胞中MBP-1表达升高

与空白对照组比较，空载感染组细胞中MBP-1 mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞ 0.05）。与空白对照组和空载感染组比较，MBP-1组细胞中MBP-1 mRNA和蛋白的表达水平升高，差异有统计学意义（P均＜ 0.05，图1，表2）。

图1 Western blot 检测结肠癌细胞中MBP-1蛋白表达

表2 三组细胞中MBP-1 mRNA和蛋白相对表达量比较（± s，n = 3）

表2 三组细胞中MBP-1 mRNA和蛋白相对表达量比较（± s，n = 3）

注：与空载感染组比较，aP ＜ 0.05；n为实验重复次数

分组 MBP-1 mRNA MBP-1蛋白空白对照组 1.00±0.13 0.16±0.02空载感染组 1.02±0.15 0.18±0.01 MBP-1组 4.56±1.03a 0.72±0.10a F 值 103.086 259.543 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

二、MBP-1过表达抑制结肠癌HCT-116细胞增殖

与空载感染组比较，MBP-1组细胞在48 h和72 h的OD 值降低，差异具有统计学意义（P均＜ 0.05，表3）。

表3 两组结肠癌HCT-116细胞的OD 值比较（± s，n = 3）

表3 两组结肠癌HCT-116细胞的OD 值比较（± s，n = 3）

注：n为实验重复次数

分组 24 h 48 h 72 h空载感染组 0.45±0.02 0.60±0.02 1.13±0.05 MBP-1组 0.41±0.06 0.43±0.03 0.52±0.09 t 值 1.551 8.276 15.895 P 值 0.583 ＜ 0.001 ＜ 0.001

三、MBP-1过表达使结肠癌HCT-116细胞阻滞于S期

与空载感染组比较，MBP-1组细胞在G0/ G1期的百分比较低，而S期和G2/M期的百分比较高，差异具有统计学意义（P均 ＜ 0.05）。与空白对照组比较，空载感染组细胞周期分布情况差别不大，差异无统计学意义（P＞ 0.05，表4）。

表4 MBP-1过表达对结肠癌HCT-116细胞周期的影响（± s，n = 3）

表4 MBP-1过表达对结肠癌HCT-116细胞周期的影响（± s，n = 3）

注：与空载感染组比较，aP ＜ 0.05；n为实验重复次数

分组 G0/G1期 S期 G2/M期空白对照组 47.58±2.25 38.45±2.06 13.95±1.15空载感染组 46.06±1.89 39.12±2.18 14.81±1.02 MBP-1组 31.36±2.02a 45.64±3.21a 23.16±2.12a F 值 170.405 22.070 101.904 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

四、MBP-1过表达诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡蛋白表达的影响

与空载感染组比较，MBP-1组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平降低，而Bax 与cleaved caspase-3蛋白表达水平均升高，差异具有统计学意义（P均＜ 0.05）。空白对照组和空载感染组之间Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平差异均无统计学意义（P均 ＞ 0.05，图2，表5）。

图2 MBP-1过表达对结肠癌HCT-116细胞凋亡蛋白表达的影响

表5 MBP-1过表达对结肠癌HCT-116细胞凋亡蛋白表达的影响（± s，n = 3）

表5 MBP-1过表达对结肠癌HCT-116细胞凋亡蛋白表达的影响（± s，n = 3）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；n为实验重复次数

分组 Bcl-2 Bax cleaved caspase-3空白对照组 0.50 ± 0.03 0.56 ± 0.08 0.43 ± 0.06空载感染组 0.52 ± 0.10 0.55 ± 0.10 0.45 ± 0.08 MBP-1组 0.23 ± 0.02a 0.76 ± 0.11a 0.81 ± 0.11a F 值 62.681 13.295 55.873 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

五、MBP-1过表达抑制结肠癌HCT-116细胞中NF-κB信号通路的活化

与空载感染组比较，MBP-1组细胞中NF- κB p65、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达水平较低，差异具有统计学意义（P均＜ 0.05）。与空白对照组比较，空载感染组中三种蛋白的表达差异无统计学意义（P均＞ 0.05，图3，表6）。

图3 Western blot 检测NF-κB p65、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达

表6 MBP-1过表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响（± s，n = 3）

表6 MBP-1过表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响（± s，n = 3）

注：与空载感染组比较，aP ＜ 0.05；n为实验重复次数

分组 NF-κB p65 c-MycCyclinD1空白对照组 0.56±0.10 0.82±0.13 0.60±0.06空载感染组 images/BZ_40_1544_1627_1545_1629.png0.61±0.13 0.79±0.15 0.62±0.09 MBP-1组 0.16±0.03a 0.43±0.05a 0.32±0.01a F 值 59.083 30.351 64.373 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

讨 论

本研究以慢病毒LV-MBP-1-GFP 感染成功上调MBP-1表达后发现，结肠癌HCT-116细胞的增殖活力受到抑制，细胞在G0/G1期比例降低，而S期和G2/M期细胞比例升高。MBP-1 基因是早期从宫颈癌细胞的cDNA表达库中克隆出来的，位于细胞核内的1p35 染色体上。作为原癌基因c-Myc的特异性抑制基因，可通过多种途径介导细胞的增殖过程，参与肿瘤的发生发展。Shi 等[11]研究发现，RNA 干扰下调MBP-1表达可通过上调Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表达促进骨肉瘤Saos-2细胞生长。结合本研究结果，提示MBP-1过表达可通过影响结肠癌细胞增殖及细胞周期进程抑制结肠癌发展进程。

本研究结果显示MBP-1过表达后NF-κB信号通路相关蛋白NF-κB p65、c-Myc和CyclinD1的表达发现，MBP-1过表达的HCT-116细胞中NF- κB p65、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达水平均明显受到抑制。NF-κB信号通路是细胞内重要的信号转导途径，NF-κB p65是该途径的关键因子，外源刺激引起NF-κB p65 进而细胞核，激活NF-κB信号通路的活化，进而调控相关基因的表达，参与细胞增殖的调节，影响结肠癌的发生发展[12-13]。CyclinD1是细胞从G1期进入S期不可或缺的周期蛋白，同时与c-Myc一样也是一种公认的原癌基因，是肿瘤生长的重要驱动子[14-15]。综合本研究实验结果，提示MBP-1过表达可通过抑制NF-κB信号通路激活进而抑制结肠癌发生发展。

陈家骅等[16]指出，上调MBP-1表达可抑制c-Myc、Cyclin D1和Cyclin E表达使细胞在G0/G1期比例降低，细胞阻滞于S期和G2/M期，进而使食管癌EC-109细胞的增殖能力减弱。Hsu 等[17]在胃癌的机制研究中发现，MBP-1 被miR-363 靶向下调后，可促进SC-M1细胞生长和上皮间质转化。然而MBP-1在结肠癌发生发展中的内在作用机制尚未完全阐明，因此通过上调结肠癌细胞中MBP-1的表达，观察其对结肠癌细胞增殖及细胞周期的影响，可为结肠癌靶向治疗研究奠定理论基础。Ghosh 等[18]研究证实，MBP-1 可通过抑制MEK5 介导的NF-κB活化抑制前列腺癌细胞生长。由此推测MBP-1是否可通过调控NF-κB信号通路进而参与结肠癌发生及发展过程，本研究经试验证明MBP-1 可能通过抑制NF-κB信号通路活化在结肠癌发生发展过程中发挥着重要的抗癌作用。

MBP-1 基因与上游miRNA 或LncRNA及其他相关信号通路的相关性尚未明确，同时还需进行体内移植瘤实验以验证实验结果，下一步研究可通过靶基因网站预测MBP-1是哪个miRNA的靶基因及其是否通过调控MBP-1 进而参与结肠癌发生及发展过程，以此丰富结肠癌靶向治疗的相关研究。