运用MLPA对自然流产绒毛组织的遗传学分析

邓桂林 马庆庆 乔印玲 卢 韦 苏远华

随着我国二胎政策的全面开放，妊娠妇女大幅度增加，高龄孕妇增多，流产患者也在不断增加。研究显示，我国流产患者中50%以上的流产原因为染色体异常，在染色体异常流产患者中染色体非整倍数异常又占绝大多数[1～2]，因此研究绒毛组织的染色体异常与自然流产的关系具有重要的作用。本医院为了探究MLPA技术在查明流产原因方面的临床价值，运用MLPA对自然流产绒毛组织进行染色体非倍体的诊断，以便指导下次妊娠，减轻患者心理负担。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本医院于2017 年6 月-2019年2 月收治的66 例自然流产患者作为研究对象，将其流产绒毛组织作为观察组，同时选择66 例来我院体检为正常生育的健康孕妇的绒毛组织作为对照组，且经过染色体检测为正常核型，所有患者年龄20～45 岁，平均年龄（32.47±2.14）岁，孕龄7～13 周，平均孕龄（8.37±1.51）周。本研究经孕妇及其家属知情且同意后，并经过伦理委员会批准。本研究观察组患者经过我院相关诊断后，均被确诊为自然流产，各项症状和指标均符合自然流产的检验标准，剔除有创伤、发热或子宫肿瘤等明显流产诱因的患者。

1.2 方法

1.2.1 流产组织DNA提取 取大概2 mg样本采用离心柱法提取DNA，并将DNA浓度标定为50 ug/μL。

1.2.2 染色体核型分析 取绒毛组织，用肉眼仔细剔除蜕模组织和血块，并用0.9%的生理盐水对组织进行多次清洗，对其进行短期培养，5 天后收获细胞，用胰酶（0.25%）处理细胞，并进行离心处理（2000 r/min）,之后使用标准的低渗液处理15 min，最后固定处理，再次离心后，取下层，再次固定，制作标本，进行染色体核型分析。

1.2.3 MLPA检测 ①探针杂交处理:提取绒毛组织基因组DNA，配置成浓度为50 ng/μL，取5 μL置于PCR反应管，进行变性处理，温度为98 ℃，变性5 min后，进行降温，降至室温后，加入3 μL探针混合液，摇匀后升温至95 ℃，处理1 min后，降温并维持温度为60 ℃，进行杂交，时间为16 h。②连接产物的制备：取32 μL连接液，置于54 ℃热循环仪中，混匀后反应15 min，并高温进行灭活处理，将制取的连接产物置于4 ℃保存。③PCR扩增：取10 μL PCR加入制备的连接产物中进行混合，混匀后进行扩增，仪器为PCR热反应仪，实行常规扩增循环，最终孵育出产物。④对产物进行检测：取1 μL的PCR产物与10 μL甲酰胺、0.4 μL的内标混匀后进行电泳分离后，置于95 ℃反应5 min，迅速降温，运用毛细血管电泳对产物进行分析和检测。

1.3 评定指标 ①检测成功率：通过运用染色体核型分析以及MLPA对66 例流产患者进行检测后，将检测成功例数占总例数的百分比作为检测成功率。②Ratio值：对分析结果进行对比，当Ratio值0.7～1.3 时表示染色体处于正常，当Ratio大小为1.5 左右，表示染色体为3 倍，当Ratio值小于0.65 时表示为染色体为单倍体。根据该标准，将Ratio值不在0.7～1.3 范围内的标本进行统计，得出染色体异常率。

1.4 统计学方法 运用SPSS 21.0 统计软件对数据进行统计处理，计数资料运用χ2检验，各组间差异比较采用方差分析，P＜0.05 表明差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 染色体核型分析以及MLPA的检测成功率分析 对66 例标本分别进行染色体核型分析以及MLPA的检测后，其检测成功率分别为74.24%和100%，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 染色体核型分析以及MLPA的检测成功率分析 (例)

2.2 自然流产患者的染色体异常率分析 66 例患 者 的Ratio值 低 于0.65 者2 例，在1.5 左 右 者4例，则染色体异常率为9.09%,与正常组染色体异常率0%相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 自然流产患者的染色体异常率分析 (例)

3 讨 论

对患者绒毛组织的染色体变异情况进行检测，有助于掌握胎儿在卵裂期之后的发育情况，能够在胎儿出现异常的早期就对患者采取适当的治疗措施，因此对患者的绒毛组织染色体异常进行分析是研究的重点[3]。

目前，检测染色体异常最常用的方法为染色体核型分析，但是其存在检测费时长、培养困难等缺点，导致检测准确率降低。随着医学的不断发展，MLPA检测技术被应用于诸多方面，该技术集合分子杂交、连接和PCR技术于一体，可同时检测出多个不同的核苷酸。该技术具有高通量、特异性高、操作简便、样本要求低、成本低廉等优点[4]。随着检测技术的不断更新和发展，将MLPA技术与基因芯片技术相结合，设计出MLPA－微阵列芯片技术，芯片技术通过检测MLPA探针的标签序列来鉴别不同位点的MLPA探针，极大地提高了基因诊断的能力[5]。本医院运用MLPA对自然流产绒毛组织进行染色体非倍体的诊断，得出该技术的诊断成功率为100%，较常规染色体核型分析得到明显提高，运用该技术检测出自然流产绒毛组织染色体变异率为9.09%,明显高于正常组。

综上所述，自然流产绒毛组织的染色体异常是导致胚胎自然流产的重要因素，针对胚胎组织染色体异常且多次自然流产的患者，建议夫妻双方行染色体检查，从而为指导下次妊娠提供重要的科学依据。