采收成熟度对雪茄烟叶晾制过程酶促棕色化反应及品质的影响

赵松超, 田培, 刘博远, 李一凡, 赵铭钦*

(1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002; 2.海南省烟草公司儋州公司, 海南 儋州 571700)

雪茄作为一种特殊的烟草制品，全部都是用烟叶卷制而成[1]，具有劲头大，烟味浓，焦油含量少等特点[2]，相较于烤烟,雪茄烟叶的颜色趋于褐色，而烟叶调制是进行酶促棕色化反应改变烟叶外观颜色的关键步骤，适度的酶促棕色化反应有利于提升晾晒烟叶的品质，改善烟叶颜色[3]。因此研究雪茄晾制过程中酶促棕色化反应对烟叶品质提升有重要意义。刘国顺等[4]认为烟叶在调制过程中失水速率随成熟度的提高而加快。王传义等[5]研究表明,多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性在调制过程中随成熟度提高而降低。较高的多酚含量有利于提高烟叶的品质[6]，多酚在烟叶调制过程中易被多酚氧化酶等氧化为醌，而醌又经过一系列反应变为褐色物质，但是被氧化较多则容易使烟叶发黑，严重影响烟叶品质[7]。烟叶生长过程中不同成熟度的化学成分是不同的[8]，因此不同成熟度的烟叶在晾制后化学成分也是有差异的。

目前，在烤烟方面不同成熟度调制对烤烟的生理变化和品质的研究较多[9-11]，而在雪茄方面却鲜有报道。海南五指山(N18°52′32″)与古巴的纬度(N21°56′22″)相近，气候条件相似，是生产优质雪茄烟叶的地区。因此本试验地选址在海南五指山，调制过程中通过设计不同成熟度雪茄烟叶，研究不同成熟度晾制对雪茄烟叶酶促棕色化反应及其化学成分的影响，旨在为雪茄烟叶的调制提供理论价值和应用参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年在海南省五指山市番阳镇(N18°52′32″，E109°23′32″)进行，该地区土壤为红色沙壤土质，碱解氮63.16 mg·kg-1，速效磷26.27 mg·kg-1，速效钾124.61 mg·kg-1，pH为5.9。试验品种为雪茄H382。

1.2 试验设计

该品种于2018年2月22日移栽，种植行距为110 cm，株距为45 cm，种植面积为6.8 hm2，施用烟草专用复合肥(N:P2O5:K2O=1∶1∶2)(湖北香青化肥有限公司)，施用量为820 kg·hm-2，采用条施，基追肥比6∶4，基肥施用量为492 kg·hm-2，追肥施用量328 kg·hm-2。施用基肥时，在移栽行将肥料施入并覆土；施追肥时将其溶于水中，在两株烟株间挖15 cm深度的坑，将溶于水的肥料注入并覆土。大田管理如中耕、培土等措施同当地常规水平一致。采收时选取大田烟株长势基本一致、叶片大小相对一致的烟株，以中部叶(第11～12叶位)为试验材料，设置3种采收成熟度即尚熟(M1)、适熟(M2)、过熟(M3)。具体试验设计及外观特征见表1。将采摘后的烟叶编杆挂入晾房，晾房规格为30 m×10 m×6 m(长×宽×高)，材料为苫布，挂杆可用长度为300 cm，每杆挂120片烟叶，每个处理标记30杆烟叶作为测试烟样，相邻挂杆间距为20 cm，采用当地晾制工艺自然晾制法晾制：晾制前期将烟叶挂于晾房下部，在低温高湿条件下进行晾制，晾制第11 d时即变黄，末期将烟叶挂于晾房上部，使烟叶在高温低湿条件下定色干筋。

表1 不同成熟度试验设计Table 1 Test designation of different maturities

1.3 测定项目及方法

1.3.1温湿度测定 在晾制开始时将testo184T1型温湿度自动记录仪(德国testo公司)悬挂于晾房前中后和上下部位，共悬挂6个，晾制过程中每天在8:00—16:00之间每2 h记录一次温湿度：前11 d记录晾房下部3个温湿度计的读数，11 d之后记录晾房上部3个温湿度计的读数，3个读数作为3次重复。

1.3.2含水率测定 从晾制开始每隔5 d随机选取晾制中各处理的3种成熟度烟叶，除去整片烟叶靠近叶尖1/3和靠近叶基部1/3，留取中间部分采用加热烘干法测定烟叶中的含水率[12]，每个处理3次重复。

1.3.3酶活性测定 从晾制开始每隔5 d随机选取晾制中各处理的3种成熟度烟叶，除去整片烟叶靠近叶尖1/3和靠近叶基部1/3，留中间部分采用比色法测定多酚氧化酶活性[13]，每个处理3次重复。

1.3.4多酚类物质测定 从晾制开始每隔5 d随机选取晾制中各处理的3种成熟度烟叶，将其烘干磨碎，过60目筛，采用2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)测定烟叶中的绿原酸、芸香苷和莨菪亭含量[14]，每个处理3次重复。

1.3.5品质指标 晾制结束后，取各处理晾后样各1 kg，将其烘干磨碎，过60目筛，采用连续流动分析法测定其常规化学成分[15]，每个处理3次重复。

1.4 数据分析与处理

采用Mircosoft Excel 2016软件进行数据分析及作图，SPSS 21.0进行显著性分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 晾制过程中温湿度的变化

晾制过程中晾房内温湿度的动态变化结果见图1，可以看出在晾制过程中温度是逐渐升高的，湿度先上升后下降。晾制前期由于晾房内装上烟叶，其晾房内部通风变差，再加上烟叶的呼吸代谢放热[16]，温度逐渐升高，此时期由于烟叶失水，晾房内相对湿度增大，而随着温度的升高，相对湿度上升一段时间后开始逐渐下降，晾制第10 d温度上升30.7%，湿度上升17.6%。第11 d之后将烟叶挂于晾房上部，烟叶所处的环境温度升高，湿度降低。

2.2 晾制过程中含水率的变化

不同成熟度烟叶晾制过程中含水率变化结果见图2，可以看出不同处理烟叶含水率变化规律相似，均随着晾制的进行而逐渐减小，且都在晾制第10 d之后快速减小。从晾制开始至晾制第10 d期间各处理含水率下降速率相对较小，同一时间点的含水率大小表现为M1>M2>M3，其中M3处理在第5 d时含水率减小较多，且与M1和M2的差异达到显著水平(P<0.05)，说明M3在第5 d时已经开始大量失水，而M1和M2含水率变化较小，且两个处理间差异不显著(P>0.05)，但在第10 d和第15 d时M1和M2差异达到显著水平(P<0.05)。第11 d时将烟叶挂于晾房顶部，烟叶所处环境由低温高湿变为高温低湿，开始大量失水，此过程3个处理烟叶含水率仍以M1最高，M3最低。第25 d时各处理间差异不显著(P>0.05)，M1、M2和M3含水率分别下降87.6%、85.1%、87.6%。结果说明M3过熟处理的烟叶晾制过程中水分损失较快。

2.3 晾制过程中多酚氧化酶活性变化

雪茄烟叶晾制过程的多酚氧化酶活性结果见图3，可以看出不同成熟度雪茄烟叶在晾制期间均呈现出单峰的变化趋势。在晾制过程中PPO活性始终表现为M1>M2>M3，在第0～10 d各处理PPO活性均处于上升趋势，在第10 d活性达到最大，此时M1、M2和M3处理的酶活性分别升高了94.2%、86.8%和55.3%，期间以M3最低，与M1和M2达到显著差异水平(P<0.05)，而M1和M2的 PPO活性在晾制5 d之后有显著差异(P<0.05)。在晾制第10～25 d PPO活性处于下降趋势，20 d之后各处理PPO活性差异不显著(P>0.05)，第25 d时M1、M2和M3分别下降92.9%、92.4%和91.6%。

2.4 晾制过程中多酚含量的变化

绿原酸、芸香苷和莨菪亭作为多酚类物质中重要的酚类，其在烟草酚类物质中含量在80%以上[17]。因此在雪茄烟叶晾制过程中通过测定绿原酸、芸香苷和莨菪亭3种酚类物质的含量来代表多酚。从图4可以看出，整个晾制过程中3种酚类物质均以M2处理含量最高。

绿原酸含量在晾制过程中表现出先稍微升高后下降的趋势，第0～5 d之间，3个处理烟叶的绿原酸含量均稍微增加，其中以M2含量最高，与M1和M3差异达到显著水平(P<0.05)，但M1与M3差异不大；在第5～10 d之间绿原酸下降速率较快，M1、M2和M3分别下降78.9%、66.0%和66.4%，期间仍以M2含量最高；晾制10 d之后开始缓慢下降，其中缓慢下降过程中M2含量最高，与M1和M3差异达到显著水平(P<0.05)，而M1和M3处理在晾制20 d之后没有显著差异，晾制25 d时M2含量最高，为1.958 mg·g-1。

芸香苷含量在晾制期内变化趋势与绿原酸相似，但与绿原酸变化趋势不同的是，芸香苷升高后一直呈现出缓慢下降的趋势。在晾制开始至晾制第5 d之间的上升阶段，芸香苷均以M2含量最高，M1和M3差异不显著(P>0.05)；在晾制第5～20 d期间，3个处理的芸香苷含量为M2>M1>M3，且各处理间差异均达到显著水平(P<0.05)，25 d时芸香苷含量仍为M2>M1>M3，但M1与M2相差不大，此时M1、M2和M3的芸香苷含量与开始相比分别下降46.0%、50.0%、62.6%。莨菪亭含量变化趋势与芸香苷相同。结果说明，M2适熟处理的烟叶晾制后多酚含量较高，适熟有利于提高多酚含量积累，而尚熟有利于减少多酚的下降比率。

2.5 酶促棕色化反应相关指标的相关性分析

由于酶促棕色化反应主要是多酚氧化酶与多酚类物质的反应[18]，根据PPO活性与多酚含量的变化，将晾制20 d之前的3个处理的酶促棕色化反应指标进行相关性分析，结果见表2。可以看出，各处理的绿原酸、芸香苷和莨菪亭3种多酚含量均与PPO活性呈现负相关，说明PPO是多酚氧化的关键酶；其中3种成熟度处理的绿原酸变化与PPO活性均呈现出显著负相关性，而芸香苷和莨菪亭含量与PPO活性的相关性没有达到显著水平，由此可以推测出PPO的氧化底物主要是绿原酸，即PPO催化的褐变底物以绿原酸为主，这与北京植物研究所鸭梨黑心病研究小组[19]研究结果一致。芸香苷含量与莨菪亭含量虽然在M2与M3处理中均达到显著正相关，但目前所知两者之间不存在有意义的关系，尚需进一步研究。

表2 不同成熟度晾制中酶促棕色化反应相关指标的相关性Table 2 The correlation analysis of related metrics enzymatic browning reaction index in different maturities during air curing

2.6 晾制成熟度对雪茄烟叶化学成分的影响

不同成熟度烟叶晾制的化学成分含量结果见表3，可以看出各处理总糖和烟碱含量差异较大，总糖含量以M2处理烟叶较高，为1.97%；烟碱含量随成熟度的提升而增加，烟叶成熟度从尚熟到过熟其烟碱含量从2.39%增大至3.18%，增幅为33.1%；钾含量M3较低，为3.41%，与M1和M2差异显著；还原糖含量为0.81%～1.47%，M2最高，为1.47%，与M1和M3差异显著，分别为M1和M3的1.56倍和1.82倍。根据优质烟叶标准[20]即还原糖含量16%～20%，总糖含量18%～22%，烟碱含量2%～3%，两糖比≥0.9，钾氯比≥4，该试验中各处理总糖含量和还原糖含量与烤烟相比普遍偏低，这是因为雪茄晾制时间较长，在此过程中烟叶的微生物进行生命活动消耗了糖类物质[21]，且烟叶自身也消耗了糖类，但相对来说以适熟烟叶的总糖含量和还原糖含量较高。而M3处理烟碱含量较高，两糖比适熟烟叶较好。综合来看，化学成分以适熟烟叶协调性较好，尚熟烟叶次之。

表3 不同成熟度的中部雪茄烟叶化学成分Table 3 Chemical composition of middle cigar tobacco leaves with different maturities

3 讨论

水分是细胞生命活动的基础，在细胞代谢过程中扮演重要的角色，在一定范围内，水分的多少直接影响着细胞生命活动的强弱[22]。在成熟期，随着烟叶成熟度的提高，烟叶组织越来越疏松，而疏松的烟叶组织失水速率较紧密的烟叶组织快[23]。在本试验中，由于不同成熟度雪茄烟叶组织紧密度不同导致3个处理在整个晾制期间含水率大小始终表现为尚熟>适熟>过熟。在晾制10 d之前，由于各处理烟叶所处环境温度较低湿度较高，烟叶失水速率较慢，但在晾制第10 d后烟叶含水率迅速下降，这是因为在晾制10 d后烟叶所处环境的温度升高、湿度降低所致。

PPO是烟草中一种重要的酶类，主要存在于叶绿体中[24]，是酶促棕色化反应的直接介导物，适当提升PPO活性有利于晾晒烟的品质[18]，调制过程中其活性大小的一个重要限制因素是烟叶含水率，烟叶含水率越高，PPO活性也就越高[25]。本试验中，3个成熟度处理的烟叶含水率差异致使晾制期间PPO活性大小始终表现为尚熟>适熟>过熟。晾制过程中，PPO活性逐渐升高可能是因为随着烟叶水分的流失，膜系统逐渐被破坏[26]，酶与底物更加充分地接触导致，也可能是随着晾制的进行，温度逐渐升高，酶活性也随之升高[27]。第10 d之后，烟叶所处环境温度升高，湿度降低，烟叶开始大量失水，从而导致酶活下降，此时尚熟烟叶中水分含量最高，因此，PPO活性以尚熟烟叶最高，之后晾房内温度持续升高，晾房内相对湿度和烟叶水分继续减少，PPO活性也随之减小。由于过高的PPO活性容易导致烟叶发黑、霉变，严重影响烟叶的品质[27]，适熟烟叶中PPO活性，更利于雪茄烟叶品质的提升。

多酚作为烟草中的重要化学物质，其含量对烟草品质有重要影响[28]。烟叶生长过程中，随着成熟度的提升多酚含量先升后降，因此本研究中适熟烟叶晾制开始时适熟烟叶多酚含量最高。本研究发现多酚含量在晾制过程中先增加后下降，增加可能是由于烟叶内的热解物如木质素等的热解转化作用导致[29]。之后绿原酸在多酚氧化酶作用下下降，而烟叶失水较快会导致细胞膜系统的破坏，使氧自由进入细胞内将绿原酸氧化[30-31]，本研究发现绿原酸含量适熟烟叶中最高，说明适熟烟叶有利于绿原酸含量的积累。10 d之后多酚氧化酶活性下降，绿原酸含量下降速率也变得较为缓慢，此时各处理烟叶失水较为严重，在多酚氧化酶和氧的作用下，绿原酸仍处于下降趋势。绿原酸作为酚类物质的主要成分，其含量的变化对烟叶质量的影响尤为重要[32]，而多酚含量与多酚氧化酶活性相关性分析说明绿原酸含量的变化主要是由多酚氧化酶活性决定的。由于多酚氧化酶主要氧化绿原酸，因此芸香苷和莨菪亭在多酚氧化酶活性较高的期间没有明显下降趋势，均呈现出先升高后缓慢下降的单峰趋势。晾制5 d之后各处理烟叶失水导致氧进入细胞氧化芸香苷和莨菪亭，因此芸香苷和莨菪亭含量开始下降，由于不同成熟度烟叶水分含量变化，适熟与尚熟烟叶两种多酚含量较高。雪茄晾制时间较长，绿原酸、芸香苷和莨菪亭被氧化较多，这也是雪茄颜色呈褐色的主要原因之一，但是多酚被氧化较多不利于烟叶颜色的定型，也不利于烟叶内在品质的提升。因此，综合考虑本试验中适熟烟叶晾制有利于雪茄烟叶品质的提升，未熟烟叶次之。

在烟叶生长过程中，随着成熟度的提高，其内在化学成分也会随之变化[33]。烟碱是烟草的重要含氮化合物，主要在烟株根系中合成，并被运输到烟叶中[34-35]，烟株在成熟过程中其根系一直具有活力[36]，因此烟株能继续从土壤中吸收氮素合成烟碱并输送至烟叶，而过熟烟叶采摘时间较晚，其烟叶内积累的烟碱较多，适熟烟叶次之，尚熟烟叶最低。本研究中，总糖和还原糖含量均以适熟烟叶最高，可能是由于适熟烟叶中淀粉含量较多且在晾制过程中适熟烟叶晾制特性较好，淀粉易降解，晾制结束后淀粉降解量最大，因此产生的糖较多[37-39]。研究发现，随着成熟度的提高，烟叶钾含量逐渐减小，可能是因为烟叶成熟时，钾离子会向其他部位转移，烟叶衰老时，钾离子则损失较大，因此过熟烟叶中钾离子较低[40]。结果表明，在该试验的3个不同成熟度处理中，以适熟烟叶中的化学成分较为协调，未熟烟叶次之。

综合来看，采收成熟度对烟叶晾制过程中含水率、多酚氧化酶活性、多酚含量和化学成分都有显著影响，适熟烟叶有利于酶促棕色化反应的进行，提高烟叶的晾制品质。因此，在海南五指山地区采收适熟雪茄烟叶进行晾制可有效提高酶促棕色化反应对雪茄烟叶的有利影响，为地区雪茄烟叶晾制提供理论价值和应用参考，也可稍微降低烟叶成熟度采摘。