北苍术枝枯病病原菌(Fusarium equiseti)的鉴定及其生物学特性研究

温晓蕾, 齐慧霞, 孙伟明, 刘一健, 冯丽娜,孟童瑶, 韩志玲, 曹佳, 王俊凤

(1.河北科技师范学院农学与生物科技学院, 河北 秦皇岛 066600;2.河北农业大学植物保护学院, 河北 保定 071001; 3.北京林业大学林学院, 北京 100083)

镰刀菌是世界性分布的真菌，种类繁多，可侵染多种寄主植物，其寄生繁殖能力强，大部分对寄主植物具有致病性并引起毁灭性病害。木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)是镰刀菌的一种，能产生毒素，在热带及亚热带地区常见，被认为是一种致病力较弱的病原菌。近年来，由于气候环境的影响，逐渐演变成致病力较强并能侵害多种寄主的病原菌[1]。主要危害作物的种子、根、茎及果实，并表现出不同的危害症状。目前,国内外已报道该病原菌能引起黄蜀葵茎枯病[2]、头花蓼茎枯病[3]、甜椒茎根腐病[4]、西瓜果实腐烂病[5]、甜哈密瓜果实腐烂病[6]、大白菜枯萎病[7]、烟草根腐病[8]、火龙果果柄腐烂病[9]等，给农业生产带来了巨大的经济损失。

北苍术是我国主要栽培中药材，随着其越来越多的药用价值被发现，国内外市场需求量日益增加[10]。然而在不断扩大北苍术种植面积的过程中，引发了各种病害的发生，种类繁多，给生产造成了严重的损失。2017年,在秦皇岛昌黎县泥井镇调查过程中发现苍术有枝枯现象，严重时能引起苍术茎枯死，甚至整株死亡的现象，并有逐渐蔓延和相互传染趋势。为了查明该地区苍术枝枯死苗的原因，对病原菌进行了分离、形态学、分子生物及致病性的鉴定，最终确定该病原菌是一种木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。1990年，徐友贵等[11]曾对由木贼镰刀菌(Fusariumegulseiti)引起的茅苍术枯萎病进行了报道，但并没有对其生物学特性等方面进行详细的研究。本研究确定其病原菌类型后，测定了不同碳氮源、pH、温度、光照等因素对其菌丝生长及产孢的影响，旨在明确其生长发育条件，为生产中有效控制病害的发生与流行提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病害样本在河北省秦皇岛昌黎县泥井镇北苍术种植基地采集，记载危害症状特点，使用自封袋封好，带回实验室，并保存于 4 ℃冰箱备用。

PSA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。

2×Mix 试剂盒(lot 01032/50334)，琼脂粉(Solarbio Cat#A8190 1214X021)购自北京康为世纪有限公司。

主要仪器有电热鼓风干燥箱(GZX-914MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-75G，上海云泰仪器仪表有限公司)、PCR仪(AG 6331CQ105783，Eppendorf)、电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)。

1.2 病原菌的分离纯化

病原菌的分离纯化采用组织分离法[12]，即取苍术茎部病、健交界处，剪切4～5 mm的小块，用75%的酒精消毒30 s，灭菌水清洗3次后接种于PSA平板上，每皿3～4块，置于25 ℃培养箱中培养3～4 d，再纯化菌株。

1.3 病原菌形态学鉴定

将病原菌接种到PSA培养基上，在25 ℃恒温培养箱中培养7 d后，观察菌落颜色、形状、大小，分生孢子的有无、形态及产生方式，厚垣孢子的有无及着生方式等形态特征，进行形态学鉴定[13]。

1.4 病原菌分子鉴定

将纯化后的病原菌接种到PSA培养基，于25 ℃恒温箱中培养3 d，收集菌丝用于分子鉴定[14-16]，利用康为试剂盒提取病原菌DNA。通过紫外可见分光光度计测定其浓度。用1%的琼脂糖凝胶检测DNA。测序序列拼接后在NCBI基因库Blast比对。

PCR扩增：采用ITS序列(ITS1:2012519908;ITS2: 2012519909)通用引物ITS1/ITS4对真菌核糖体基因转录间隔区域进行PCR扩增，引物序列ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

扩增总体系为25 μL：2×TaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR扩增程序为：热盖温度为105 ℃，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 33个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃恒温保存。得到ITS扩增产物后，用1.0%琼脂糖凝胶检验扩增产物，PCR产物样品合格后送上海生工生物工程有限公司测序。

序列分析：将测序结果通过DNAMAN软件进行序列拼接，并将所得序列与GenBank中的ITS序列进行分析比对。通过MEGA7.0软件构建系统发育树，更准确地鉴定病原菌的种类。

1.5 致病性测定

采用活体伤口接种法[17-18]测定致病性。选择健康无病的苍术，取其上、下部位茎，以75%的酒精对苍术茎部进行表面消毒，再用无菌水冲洗、晾干。用消毒的刀片在叶片及茎部划出伤口，将在PDA上培养7 d的病原菌，使用打孔器取直径5 mm的菌饼贴在灭菌脱脂棉上，将脱脂棉分别贴在枝条伤口处，并用保鲜膜缠绕包裹，同时接种无伤口叶片及茎，以无菌PDA菌饼作对照，每个处理接种3株，保湿培养24 h，去掉菌饼，观察发病情况。从接种发病的叶片及茎部上再次分离病原菌，完成柯赫氏法则验证。

1.6 病原菌生物学特性研究

1.6.1培养基 将直径为 5 mm的病原菌菌饼移转接到PDA培养基、燕麦培养基、PSA培养基和玉米培养基平板中央，每个处理3次重复，于25 ℃恒温箱中培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径。

1.6.2温度 选用PSA作为基础培养基，将菌饼(5 mm)接种于平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒温培养箱中培养7 d，观察与测量菌落直径。

1.6.3pH 使用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl调节培养基的pH为4、5、6、7、8、9、10、11，转接病原菌菌饼(5 mm)于PSA培养基中央，25 ℃恒温培养7 d,观察与测量菌落直径。

1.6.4光照 将病原菌菌饼(5 mm)移转接到PSA平板，培养条件为24 h全黑暗、24 h全光照、12 h光暗交替，于25 ℃恒温培养7 d，观察与测量菌落直径。

1.6.5碳源和氮源 碳源筛选：以PSA为基础培养基，分别用等量的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉、D-木糖醇代替蔗糖作为唯一碳源。

氮源筛选：以PSA为基础培养基，用酵母浸出液、牛肉膏、蛋白胨、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵和尿素作为氮源。

将病原菌菌饼(5 mm)转接于平板中央，于25 ℃培养7 d，观察与测量菌落直径。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

2.1.1病原菌形态学鉴定 北苍术主要受害部位在茎部，发病时茎部多处变褐，病、健交界明显，严重时蔓延到整个植株，直至枯死。病株最初茎基部失绿，然后向上逐渐蔓延，整株发黄枯死，叶片不脱落。横切病株基部，维管束变褐色。

在25 ℃恒温条件下，致病菌在PSA 培养基上初期气生菌丝呈绒毛状至棉絮状，颜色为白色至粉红色，之后发展为浅驼色菌丝(图1A、B)，可长橘黄色分生孢子座，基物表面黄色至淡褐色，最终变为土黄色。小型分生孢子少，大型分生孢子镰刀型，弯曲，中部细胞显著膨大，顶孢延长呈锥形，3～7个隔膜，多数为3～5个分隔(图1C)，1～2隔膜的大小为(11～38.5) μm×(3～4.5) μm，3～4隔膜的大小为(16.5～87.5) μm×(3～6) μm。厚垣孢子呈球形，直径6～9 μm，成链状或单生于菌丝或孢子中，产孢细胞单瓶梗，分枝或不分枝(图1D)。

2.1.2致病性测定 致病性测定结果表明，接种后第3 d植株开始发病，接种茎部变为浅褐色，由于高湿度条件，病部逐渐加重，病斑颜色由浅褐色逐渐变深褐色，到第8 d植株茎部明显变褐枯死，无接种病菌的对照组植株均未发病且生长良好。用常规组织分离法再次分离病原物，所得真菌与用来接种的病菌相同，证实其为致病菌。

2.1.3病原菌分子鉴定 针对真菌ITS基因序列对分离菌株进行PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条大小约 500 bp 的片段，经测序确定长度为 513 bp，并将序列提交GenBank(Accession No. MH290363)。Blastn比对显示该病原菌的ITS序列与木贼镰刀菌Fusariumequiseti(GenBank accession No. MK621018)的相似性达到100%。采用MEGA X.软件构建的系统发育树(图2)，发现分离的菌株与Fusariumequiseti在同一个分支上，且相似性为100%。

2.2 病原菌最佳培养条件的筛选

2.2.1培养基对菌丝生长的影响 由图3可知，病原菌(Fusariumequiseti)在4种培养基上均能正常生长，其中燕麦及玉米面培养基最适合病原菌的生长，到第7 d时，菌落直径均为8.50 cm，其次为PSA培养基，菌落直径均为7.48 cm，在PDA培养基上生长最慢。

2.2.2温度对病菌菌丝生长的影响 温度对病原菌(Fusariumequiseti)的影响如图4所示,病原菌在温度为10～35 ℃时均能生长，其最适生长温度为25～30 ℃，其菌落直径分别为7.43、7.77 cm，在温度为35 ℃时，菌落生长略显缓慢，到第7 d时，菌落直径为6.76 cm；当培养温度低于25 ℃时，不利于病原菌的生长，尤其是在低温5 ℃时，病原菌基本停止生长。

2.2.3pH对病菌菌丝生长的影响 通过调节培养基的pH来测定木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)在不同酸碱条件下生长情况，结果发现,其在pH 4～11时均能正常生长(图5)，该病原菌在8～11时最适合菌丝生长，第7 d时，菌落直径均在8.00 cm以上。

2.2.4光照对菌丝生长的影响 由图6所示，木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)喜光，在光照条件下有利于病原菌的生长，尤其是在全光照(24 h)条件下，最适合病原菌菌丝的生长，第7 d时，其菌落直径8.00 cm，全黑暗不利于病原菌的生长。

2.2.5碳源、氮源对菌丝生长的影响 病原菌(Fusariumequiseti)对7种不同碳氮源的利用如表1所示：病原菌在7种碳源上均能正常生长，分别在含有淀粉、葡萄糖、D-木糖醇的培养基上菌丝生长最好，第7 d菌落直径分别为7.05、6.88、6.62 cm；对氮源酵母浸出粉利用率最高，7 d时菌落直径为8.50 cm，其次为尿素；牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵不利于该致病菌菌丝的生长。

表1 碳源、氮源对菌丝生长的影响Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on mycelium growth

3 讨论

试验采用形态学特征及分子生物学相结合的方法，明确了引起北苍术枝枯病的致病菌为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)，该病原菌分布广泛，能引起多种植物的病害。通过对其进行生物学特性研究时发现，该病原菌最适培养基为燕麦及玉米面，在温度为 25～30 ℃、pH为8～11、全光照条件下生长最快，并且对碳源淀粉、葡萄糖及氮源酵母浸出粉利用率最高，培养7 d时菌落直径在7 cm左右。2017年，秦云霞等[19]对引起橡胶树基腐病木贼镰刀菌的生物学特性分析结果表明，菌株Fusarium-Hb适宜生长温度为16～35 ℃，pH 4～11均能生长，在光照条件下菌丝生长最快，对碳源葡萄糖、蔗糖及麦芽糖利用最好，这与本研究结果基本一致。但菌株Fusarium-Hb对氮源硝酸钾利用最好，这与本研究结果有所不同，产生这种现象的原因可能是由于不同地域而导致菌株对氮源利用有所不同。木贼镰刀菌也能引起辣木枝枯病，康讯等[20]对该病原菌生物学特性进行研究，结果表明，菌丝生长适宜条件为温度25～30 ℃，pH 6～8，光照有利于菌丝的生长，与本研究结果相似。但金社林等[21]研究发现，引起玉米穗腐病的木贼镰刀菌菌丝生长的最适生长温度为25 ℃，黑暗条件下菌丝生长最快，这与本研究结果不同，产生这种差异可能与当地的气候条件有关。

本文对引起北苍术枝枯病病原菌进行了较为系统的研究，对生产上防控病害的发生具有指导性意义。目前对北苍术病害的研究较少，为了更好的服务于生产，本研究后续将对枝枯病病原菌的侵染循环、发生规律以及药剂筛选等试验进行下一步研究，为生产上能更好的防控该病害提供理论依据。