牛羊源沙门氏菌在某定点屠宰场和农贸市场的污染分布与耐药性调查

刘英玉，郑晓风，李睿鹏,郑晓琴，朱梦含，胥 兰，朱明月，卢 玮，姚 刚

(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】沙门氏菌是动物源疾病和食物源疾病中常见的病菌，有广泛的宿主，几乎能感染人和所有的温血动物[1]。沙门氏菌感染能引起败血症、肠胃炎、怀孕家畜的流产。沙门氏菌是革兰氏阴性致病菌，血清型繁多，目前全世界已分离出2 523个血清型。食源性疾病的影响是巨大的[2]，主要传播途径涉及运输中的动物和未煮熟的动物食品。沙门氏菌的研究在公共卫生方面具有现实意义。【前人研究进展】屠宰场中食用动物的屠宰过程被认为是沙门氏菌引起内脏和胴体污染的重要来源之一[3]。近年来抗菌药物在临床上使用越来越普遍，在抗生素的选择性压力下，会导致沙门氏菌对抗菌药物的耐药问题愈发严峻，也间接使沙门氏菌血清型以及对抗菌药物的耐药种类不断增多[4]。【本研究切入点】耐药及多重耐药食源性病原体的出现引起了广泛关注。调查研究牛羊源沙门氏菌在某定点屠宰场和农贸市场的污染分布与耐药性调查。【拟解决的关键问题】调查某定点屠宰场和农贸市场环节中牛羊源沙门氏菌的污染情况，采用国家标准方法进行分离鉴定，并用纸片法检测沙门氏菌的耐药情况，分析新疆地区某定点屠宰场和农贸市场中胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品的牛羊源沙门氏菌的污染程度，分析明确菌株的耐药性。

1 材料与方法

1.1 材 料

2018年7月在乌鲁木齐市某牛羊定点屠宰场采集牛羊胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品159份，2018年9月在库尔勒市某牛羊农贸市场采集牛羊胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品177份，2018年10月在库尔勒市某牛羊农贸市场采集牛羊胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品94份，2018年10月在库尔勒市某牛羊定点屠宰场采集牛羊胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品155份，2018年11月在乌鲁木齐市某牛羊定点屠宰场采集羊胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品96份，2019年3月前往乌鲁木齐市某牛羊定点屠宰场采集牛胴体拭子、肉样、加工用具拭子样品160份，共采集样本841份。采用灭菌棉棒采集胴体拭子、肉样、加工用具表面拭子，装于灭菌的离心管中，低温带回实验室尽快操作。

缓冲蛋白胨水、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂、四硫磺酸钠煌绿增菌液、三糖铁琼脂、沙门氏菌生化试剂盒均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；革兰氏阴性杆菌药敏试纸盒购自杭州天和微生物试剂有限公司。TAE购自北京鼎国昌盛有限公司；TaqMasterMix、DNA Marker购自Takara生物公司。

LDZX-50 KB立式压力蒸汽高压锅购自上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD博迅净化工作台购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9162恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；PL203电子天平购自梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司；DYCP-31 DN水平电泳槽和 DYCP-31 DN稳压稳流电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；GELDOCXR+凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司。

大肠杆菌质控菌ATCC25922购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离鉴定

按照国家标准方法食品微生物学检验 沙门氏菌检验(GB 4789.4～2016)[6]，分别取粪拭子至9 mL的缓冲蛋白胨水中，置于37℃恒温摇床中以180～200 r/min增菌18～24 h。取缓冲蛋白胨水中的菌液分别至四硫磺酸钠煌绿增菌液中，置于37℃恒温摇床中以180～200 r/min增菌18～24 h。后将增菌液分别划线接种至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂琼脂上，置于37℃恒温培养箱中培养18～24 h。挑取木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂上带黑心的菌落穿刺至三糖铁琼脂中，再接种至生化试剂赖氨酸脱羧酶肉汤、氰化钾、尿素酶、蛋白胨水中，置于37℃恒温培养箱中培养18～24 h，必要时延长至48 h。结果的判断按照生化试剂盒中的颜色进行判断。

应用国家标准方法GB 4789.4～2016对2018年7月到2019年3月在定点屠宰场和农贸市场环节采集的841份牛羊源样品进行选择性增菌和培养鉴定，挑取粉红色菌落中间带有黑色的典型菌落的进行生化鉴定，按照国家标准方法GB 4789.4-2016的判断依据。

1.2.2 药物敏感性

按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的手册[7]的Kirby-Bauer纸片扩散法对分离的菌株进行6大类17种药物进行耐药性检测。青霉素类(氨苄西林，哌拉西林)；头孢菌素类(头孢呋辛、头孢西叮、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟)；β-内酰胺类(氨曲南)；氨基糖苷类(链霉素、妥布霉素、卡那霉素)；喹诺酮类(氧氟沙星)；大环内酯类(麦迪霉素)。用大肠杆菌ATCC 25922作质控菌株，判定标准按美国NCCLS操作标准。

1.3 数据处理

试验数据采用Office Excel 2013软件进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 牛羊源沙门氏菌的分离鉴定

研究表明,A1.沙门氏菌属有21株，A2.沙门氏菌属有1株，甲型副伤寒有8株，沙门氏菌个别变体有17株。共分离出47株沙门氏菌属，沙门氏菌分离率为5.59%。表1。

表1 样品采样信息和沙门氏菌分离鉴定

Table 1 Sample information and results ofSalmonellaisolation and identification

日期Date地点Area采样点Samplinglocations2018.92018.102018.72018.112019.3库尔勒市Korla乌鲁木齐市Urumqi市场Market屠宰场Slaughterhouse屠宰场Slaughterhouse动物种类Animalspecies羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle胴体拭子Carcassswab67541719564734405885菌株数Numberofstrains3411032315分离率Separationrate(%)4.487.415.885.2606.385.887.51.725.88肉样meat23271310191818142235菌株数Numberofstrains3100100319分离率Separationrate(%)13.043.7005.260021.434.5525.71加工用具拭子Processingtoolswab6351530231640菌株数Numberofstrains1101210分离率Separationrate(%)16.672.8603.338.76.250样品合计Totalsample968165299065827796160

牛羊源沙门氏菌在胴体拭子、肉样、加工用具拭子的分离率分别为4.82%、9.05%、3.64%，在屠宰场中共采集牛羊胴体拭子320份，分离鉴定出14株沙门氏菌，分离率为4.38%；采集肉样126份，分离鉴定出14株沙门氏菌，分离率为11.11%；采集加工用具拭子124份，分离鉴定出4株沙门氏菌，分离率为3.23%。在屠宰场中沙门氏菌污染程度依次为：加工用具拭子<胴体拭子<肉样。在农贸市场中共采集牛羊胴体拭子157份，分离鉴定出9株沙门氏菌，分离率为5.73%；采集肉样73份，分离鉴定出4株沙门氏菌，分离率为5.48%；采集加工用具拭子41份，分离鉴定出2株沙门氏菌，分离率为4.88%。在农贸市场中沙门氏菌污染程度依次为：加工用具拭子<肉样<胴体拭子。图1

图1 牛羊源沙门氏菌在胴体拭子、肉样、加工用具拭子的污染分布

Fig.1 Pollution distribution ofSalmonellafrom cattle and sheep in carcass swabs, meat samples and processing equipment swabs

2.2 沙门氏菌的耐药性

研究表明,对17种抗菌药物均存在不同程度的耐药，耐药率为2.13%～59.57%：氨苄西林(AMP)的耐药率为36.17%、哌拉西林(PIP)的耐药率为17.02%、头孢呋辛(FRX)的耐药率为25.53%、头孢噻吩(CEP)的耐药率为34.04%、头孢哌酮(CFP)的耐药率为10.64%、头孢他啶(CAZ)的耐药率为8.51%、头孢曲松(CTRX)的耐药率为8.51%、头孢西叮(FOX)的耐药率为10.64%、头孢唑啉(CZO)的耐药率为25.53%、头孢吡肟(FEP)的耐药率为6.38%、头孢噻肟(CTX)的耐药率为10.64%、氨曲南(AZT)的耐药率为2.13%、链霉素(STR)的耐药率为12.77%、妥布霉素(TOB)的耐药率为14.89%、卡那霉素(KAN)的耐药率为19.15%、氧氟沙星(OFLX)的耐药率为23.40%、麦迪霉素(MID)的耐药率为59.57%。图2

注：耐药(R)、中介(I)、敏感(S)

Note: Resistance(R); Intermediate(I); Sensitivity(S)

图2 牛羊源沙门氏菌的耐药性

Fig.2 Drug resistance of sheep and bovineSalmonella

表2 牛羊源沙门氏菌的多重耐药谱

Table 2 Multidrug resistance spectra ofSalmonellafrom Bovine and Sheep

多重耐药Multipledrugresistance耐药谱Drug-resistantspectrum1麦迪霉素(4);氧氟沙星(4);氨苄西林(1)2麦迪霉素+头孢噻吩(2);麦迪霉素+氨苄西林(2);麦迪霉素+卡那霉素(1);麦迪霉素+头孢他啶(1);头孢呋辛+头孢噻吩(1)3麦迪霉素+卡那霉素+氨苄西林(1);麦迪霉素+氧氟沙星+头孢噻吩(1);麦迪霉素+头孢噻肟+头孢噻吩(1);氧氟沙星+头孢噻肟+哌拉西林(1);麦迪霉素+妥布霉素+头孢噻吩(1);麦迪霉素+头孢西叮+氨苄西林(1);氧氟沙星+氨曲南+头孢哌酮(1)4链霉素+头孢唑林+头孢呋辛+氨苄西林(1);麦迪霉素+头孢唑林+头孢噻吩+头孢呋辛(1);链霉素+头孢哌酮+头孢噻吩+头孢呋辛(1);麦迪霉素+头孢他啶+哌拉西林+氨苄西林(1);麦迪霉素+头孢吡肟+头孢呋辛+哌拉西林(1);麦迪霉素+链霉素+头孢唑林+氨苄西林(1)506麦迪霉素+卡那霉素+头孢唑林+头孢噻吩+头孢呋辛+氨苄西林(2);麦迪霉素+卡那霉素+妥布霉素+链霉素+哌拉西林+氨苄西林(1)7氧氟沙星+妥布霉素+头孢噻肟+头孢吡肟+头孢西叮+头孢噻吩+头孢呋辛(1);麦迪霉素+氧氟沙星+头孢噻肟+头孢唑林+头孢西叮+头孢曲松+哌拉西林(1)8麦迪霉素+氧氟沙星+卡那霉素+妥布霉素+链霉素+头孢唑林+头孢噻吩+氨苄西林(1);麦迪霉素+卡那霉素+头孢唑林+头孢哌酮+头孢噻吩+头孢呋辛+哌拉西林+氨苄西林(1)9麦迪霉素+卡那霉素+妥布霉素+链霉素+头孢唑林+头孢他啶+头孢噻吩+头孢呋辛+氨苄西林(1);麦迪霉素+头孢噻肟+头孢吡肟+头孢唑林+头孢曲松+头孢他啶+头孢噻吩+头孢呋辛+氨苄西林(1);妥布霉素+头孢唑林+头孢西叮+头孢曲松+头孢哌酮+头孢噻吩+头孢呋辛+哌拉西林+氨苄西林(1)10011012麦迪霉素+卡那霉素+妥布霉素+链霉素+头孢唑林+头孢西叮+头孢曲松+头孢哌酮+头孢噻吩+头孢呋辛+哌拉西林+氨苄西林(1)

研究表明,只有7株沙门氏菌不耐药，菌株来源是屠宰场样品，有9株沙门氏菌耐1种抗菌药，单耐药率为19.15%，菌株来源也是屠宰场样品；有7株沙门氏菌耐2种抗菌药，2重耐药率为14.29%，菌株来源也是屠宰场样品，以麦迪霉素+头孢噻吩和麦迪霉素+氨苄西林为主；7株沙门氏菌耐3种抗菌药，3重耐药率为14.29%；6株沙门氏菌耐4种抗菌药，4重耐药率为12.24%；3株沙门氏菌耐6种抗菌药，6重耐药率为6.12%；2株沙门氏菌耐7种抗菌药，7重耐药率为4.08%；2株沙门氏菌耐8种抗菌药，8重耐药率为4.08%；3株沙门氏菌耐9种抗菌药，9重耐药率为6.12%；1株沙门氏菌耐12种抗菌药，12重耐药率为2.04%；耐药谱如表2。市场中沙门氏菌的耐药现象比屠宰场的耐药严重。表2

3 讨 论

从某定点屠宰场和农贸市场中分离鉴定出47株沙门氏菌，分离率为5.59%，牛羊源沙门氏菌在胴体拭子、肉样、加工用具拭子的分离率分别为4.82%、8.54%、4.52%。Khan等[7]报道家庭式家禽加工厂和超市采集的鸡胴体样品中沙门氏菌的流行率分别为20.5%和8.3%。Mcevoy等[8]报告在爱尔兰的商业屠宰场从粪便、瘤胃和胴体样品中沙门氏菌的分离率分别为2%、2%、7.6%。2005年美国在牛肉中沙门氏菌中鼠伤寒沙门氏菌排在首位，分离率为24.7%[9]。研究中检测出8株甲型副伤寒沙门氏菌，分离率为17.02%(8/47)。

某定点屠宰场和农贸市场中分离鉴定的47株沙门氏菌对17种抗菌药物均存在不同程度的耐药，耐药率为2.13%～59.57%，对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻吩、头孢唑啉、卡那霉素、氧氟沙星、麦迪霉素等具有较高的耐药性。谌南辉等[10]人对分离得到的33株鸡白痢沙门氏菌进行了耐药性的研究，得出这些菌株均对新生霉素、麦迪霉素、链霉素等具有耐药性，其中部分对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素具有耐药性。谭炳乾[11]对16株猪伤寒沙门氏菌进行包括四环素在内的12中常见抗菌药物的耐药研究，发现其耐药率达31.3%～93.8%。黎旭宇等[12]从兽医临床中分离得到沙门氏菌，并对其进行耐药性进行检测，发现对氨苄西林耐药率达90%，而对土霉素的耐药率达到100%。目前临床上主要应用青霉素类和头孢菌素类抗生素治疗沙门氏菌感染。试验菌株对氨苄青霉素和头孢噻吩、头孢唑啉表现出较高的耐药率，而对头孢他啶、头孢曲松等其他几种头孢菌素类抗生素耐药率相对较低。

4 结 论

从乌鲁木齐市某定点屠宰场、库尔勒市某定点屠宰场和农贸市场采集的841份样品中分离鉴定出47株沙门氏菌属，分离率为5.59%。在屠宰场中沙门氏菌污染程度依次为胴体拭子<加工用具拭子<肉样。而在农贸市场中沙门氏菌污染程度依次为加工用具拭子<肉样<胴体拭子。对17种抗菌药物均存在不同程度的耐药，耐药率为2.13%～59.57%，多重耐药现象严重，其中有1株沙门氏菌耐12种抗菌药。沙门氏菌在屠宰和市场环节均存在污染，且大多数都是耐药菌株。