闫帅帅, 郭 亮, 张闻桐, 李孟华, 刘 箐
上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093
作为生命中最小的功能单元,单个细胞是地球上所有生物的基本组成部分和进化的基本单位[1]。在看似相同的细胞群中,细胞个体性和差异性在生物学的许多关键领域中发挥着重要作用[2]。充分了解单个细胞的异质性是阐述细胞分化、癌症的起源、微生物进化以及环境微生物群落功能等分子机制的基础[3,4]。因此,研究单个细胞以了解异质群体的复杂生物学并应用于个性化医疗和耐药细胞抗性等研究领域[5,6]。对单细胞进行无损、无标记、准确、高通量的分选是分析细胞间功能异质性并探究自然界尚未培养微生物的关键工具[7]。
传统的间接细胞分选是基于外部基因编码的荧光蛋白标记或磁性分子和化合物标记进行细胞的预分选,包括荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)和磁激活细胞分选(magnetically-activated cell sorting, MACS),尽管它们都满足高通量的需求,但是外加标记或修饰可能会影响甚至改变细胞原本的状态[8,9]。因此,开发无损、无标记的功能性细胞分选的高通量技术是发展单细胞分析科学的必要条件[10]。拉曼光谱技术作为一种无标记的生化指纹技术,能够揭示单个细胞的内在化学信息,对单细胞研究具有很大的潜力[11,12]。此外,拉曼光谱与单细胞操作技术(包括液体溶液中的微流控、微液滴、光镊技术以及芯片上的激光喷射技术)相结合,可以实现对目标细胞的分选,即拉曼激活细胞分选技术(Raman-activated cell sorting, RACS)[13-16]。
在过去的大约15年中,拉曼光谱已成为一种成熟的分析工具,可用于无损、快速地表征和鉴定单个细胞[17]。拉曼散射由光与分子的非弹性相互作用产生,光谱信号对应于化学键的振动,其依靠激发光的非弹性散射和分子共振可以对单个细胞产生独特“指纹图谱”[18,19]。因为SCRS本质上是分子振动的集合,其通常包含1000多个拉曼谱带代表核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质等分类学标记的不同振动模式,体现了单个细胞丰富而复杂的固有信息,反映了细胞的基因表达、特定化合物的生物合成、细胞成分、特征结构、生理状态和代谢状况等[20-22]。HANSON等[23]通过SCRS将置于不同营养环境和生长阶段的分支杆菌进行了区分和鉴定。HO等[24]对30株临床病原菌的单层细胞仅采集1 s的时间,通过卷积神经网络的方法对不同菌株进行了区分和鉴定,达到了82%的准确率,并成功应用于相关临床症状患者。此外,细胞中具有强拉曼响应的特征物质对靶细胞的表型表征至关重要,SONG等[25]基于类胡萝卜素独特的拉曼特征谱带将海水样品中光养细菌进行分类,GUO等[26]通过D2O同位素标记鉴定了饮用水中的不可培养细菌的代谢活性。GERMOND等[27]通过SCRS将大肠杆菌耐受和不耐受β-内酰胺类、喹诺酮类等抗生素的细菌进行了区分,并进行相关基因型的分析,将单细胞表型和基因型相联系。
将传统的SCRS技术与通道微流体系统相结合,能够实现单细胞的计数和分选,并维持靶细胞活力。通道微流体系统是由软光刻技术修饰的聚二甲基硅氧烷(PDMS)与玻璃组件相粘连形成多层、多通道的纳米级微管、腔室和阀门组成[28,29]。通过施加压力使微流体获得流体动力,以一定的流速来控制细胞样品量,经过下游的单细胞拉曼特异性检测,利用滞留力(机械力、光学、磁力、介电泳等)对靶细胞进行捕获[30]。例如,LI等[31]基于特异性类胡萝卜素拉曼谱带信号强的优势,在微流体系统中对C12和C13标记的蓝细菌细胞进行计数。针对单细胞自发拉曼信号弱的劣势,NOLAN等[32]将金属纳米粒子多重SERS标签与抗体或靶标分子相偶联,在微流体系统中特异性的捕获靶细胞,通过SERS纳米标签产生强而窄拉曼信号,从而实现对靶细胞的多参数单细胞群体分析。
介电电泳(Dielectrophoresis, DEP)是在非均匀电场中由极化效应引起的中性物质的平移运动,可以直接在流体中捕获微米级、纳米级的微粒,实现对靶细胞的捕获[33]。在SCHRÖDER等研究中,通过DEP可以在几分钟内将悬浮液中大肠杆菌和粪肠球菌进行分离和捕获,并结合SCRS和多元统计分析实现对尿路感染患者的病原微生物分类[34]。CHRIMES等[35]首创的微流体-SERS-DEP系统对单个酵母细胞在不同生长阶段所分泌的化学物质进行了原位动态检测。利用SERS信号的强度对基于DEP固定在微流体环境中的细胞进行化学监测,从而分析酵母细胞的代谢、增殖、凋亡以及细胞之间的化学传递。ZHANG等[36]开发了一种间歇排序的RACS微流控系统,通过施加周期性的正介电电泳(positive DEP, pDEP)场,实现对单细胞的捕获、排序并分别定位到用于拉曼测量的检测点,并结合电磁阀吸气的开关以进行细胞分离,并成功用于基于类胡萝卜素谱带的酵母细胞的亚秒级分选。使得在高速流微流体中通过拉曼识别单个细胞和自动分选成为可能。
当基于外在的“滞留力”对单个细胞进行捕获或固定化时,可能会影响细胞原有的生理状态,对检测、分析细胞群体异质性造成影响。MCLLVENNA等[37]开发无需靶细胞捕获的拉曼微流控系统,其中的微流体压力分配器基于内在拉曼信号对单个细胞进行连续和自动分选。其中根据C12或C13标记的蓝细菌中的特异性类胡萝卜素拉曼谱带在2 s内实现了单个细胞的拉曼光谱测量和分选。ZHANG等[38]建立的32通道多重受激拉曼散射流式细胞系统,在3 s内将约400分化的和1 300个未分化的3T3-L1细胞进行分类和鉴定。
液滴微流体技术是微流控技术的重要分支,它利用水和油的不相溶性来制造微升或纳升级液滴微反应器,简单、快速的实现对悬浮液中的单个细胞进行封装[39,40]。微液滴基于其直径的可控性、对单细胞封装的便捷性、避免交叉感染的微反应器等优势,使其成为的理想高通量单细胞分析技术[41]。
KIM等[42]将拉曼光谱、PDMS与微液滴系统偶联,用微液滴包裹莱茵衣藻细胞,原位表征了其脂质随时间的变化。但是,微液滴凹凸表面和油性介质可能对靶细胞的拉曼信号产生影响。WANG等[43]开发的拉曼激活液滴分选系统(Raman-activated droplet sorting,RADS)针对上述缺陷进行了改进,在液滴产生之前就对靶细胞进行SCRS检测,其主要对不同虾青素产能的单细胞绿藻进行了分选和鉴定。首先将细胞悬液加载到芯片为通道中,在两个夹流的作用下使其形成单细胞流,当细胞通过激光点时获得SCRS,然后用微液滴将单个细胞进行封装,经过特定的延迟后,含有靶细胞的液滴通过DEP进行分选并流入收集通道,而非目标液滴将流入废物通道。并且此系统的通量为每分钟分选260个细胞,且可以维持分选靶细胞的活性。
XU等将微液滴系统与SERS相结合对不同癌症细胞代谢异质性进行了分析。研究了癌细胞系(HepG2和BNL.CL2)中碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,API)的表达,将细胞悬液、BCIP(API的催化底物)和金纳米颗粒共孵育后作为整体被包裹于微液滴中,将其置于三个平行通道的微芯片中,对产生的共振拉曼活性物质BCI(API的催化产物)进行SERS检测[44]。此外,还建立了一种高通量、双通道、基于SERS的等离子体微滴平台用于检测癌细胞系(MCF-7,HepG2,SGC和BNL.CL2)表面的唾液酸,并且在单细胞水平上成功的区分了不同癌细胞系。因此微液滴系统不仅可以分选单个靶细胞直接用于分类和鉴定,还可以通过分选靶细胞来间接研究相关代谢活性物质,有利于全面研究细胞群体的异质性和复杂性[45]。在药物医学,癌症诊断和单细胞遗传分析等临床应用中具有潜在的价值。
高度聚焦的激光束形成的光学镊子提供非接触式捕获力来物理固定和移动溶液中的单个细胞,同时,激光束作为激发源以生成靶细胞的拉曼指纹图谱用于分类或鉴定[46]。近年来,这种高通量、无标记的拉曼光谱与光镊技术相结合,用于研究微通道中的单个细胞已经取得了很大的进展。
在早期拉曼光镊技术用于单细胞分析时,通常是光镊捕获、固定细胞后,人工进行辅助操作,将靶细胞移至收集区域。XIE等[47]利用拉曼光镊技术将有活性和无活性的酵母细胞选择性的分类到不同的收集区域,并进行验证。HUANG等[48]利用拉曼光镊技术识别毛细管中的目标细胞,然后手动将单细胞移至毛细管一端,进行下游分析。随着高通量、自动化要求越来越高,更加符合单细胞分选条件的拉曼光镊的技术平台被逐步开发和完善。LAU等[49]将多通道微流体设备和激光镊子拉曼光谱相结合,集成的RACS自动化平台直接将细胞递送至激光阱拉曼系统并基于其拉曼特征对细胞进行分选,并成功用于识别和分类两种白血病细胞系,但是每个光谱采集时间需要120 s,耗时较高。DOCHOW等[50]将上述分选系统进行改进,仅用10 s就可以对单细胞进行光谱采集、捕获和收集,大大提高了分选的速率,并且可以用线性判别分析对五种细胞进行分类和识别。FANG等[51]设计了一个葫芦状的微通道分选芯片,与拉曼光镊相结合可以同时获得一个独立的单个细胞及其拉曼光谱,对四种不同细胞进行了精确的单细胞分离,但是每次细胞分离需要3 min,分选速度收到了极大的限制。为了研究多种细菌群落的复杂性和异质性,LEE等[52]建立了一个基于同位素标记对活细胞进行分类的拉曼光镊的自动化光流体平台,此方法与前人研究最大的区别是不受限于包含强拉曼相应的标志物的影响,适用于广泛的单细胞分选。通过对四种模型细菌的分选,在高精度的提前下,每分钟可以分选3.3~3.8个细胞。虽然,拉曼光镊与微流控结合大大提高了单细胞的分选精度,但是需要进一步的创新以实现更高的细胞分选率。
对于复杂的自然界微生物群体在单细胞水平进行异质性分析时,最好保持其原始的环境和状态。此外,许多微生物存在于土壤、粪便、生物膜等复杂固体介质中,不适用于微液体相关的RACS技术进行分析[53]。因此,利用拉曼激活细胞弹射(Raman-activated cell ejection, RACE)技术能够对感兴趣的单细胞进行原位分选[54]。
RACE的概念在2013年第一次被提出,目标细胞置于涂有CaF2的载玻片上进行SCRS的采集,然后用激光诱导正向转移技术从玻片上对靶细胞进行分离[16]。但是此系统由个模块配合完成,并且通过高功率激光的作用,会对单细胞造成损伤,不利于下游的测序分析。因此,SONG等[25]开发了一套多合一的RACE系统,在玻片上涂无拉曼信号Al层对目标细胞进行SCRS采集,记录靶细胞位置,将玻片翻转后再进行单细胞分选,通过基于类胡萝卜素拉曼信号作为生物标记物成功鉴定了红海样品中的潜在光养细菌,并推测了相关基因型。但是,所使用的玻片在翻转过程中可能造成污染,对下游的全基因组扩增和测序造成影响。JING等[55]基于上述劣势,将涂有铟锡氧化物的透明的石英分选芯片与收集装置合二为一,更完善了RACE的分选模块,通过对中国黄海中光合细菌的同位素标记和靶细胞的RACE,并结合下游测序重新编码了两个关键细菌CO2固定代谢途径的近乎完整的基因组。WANG等[56,57]在前人研究的基础上,利用RACE系统对人类肠道菌群中功能性细菌的相关代谢途径和耐药性等进行了表型和基因型的分析。然而,RACE系统分选的细胞大多不具有细胞活性,达不到对原位分选的单细胞进行培养的需求。
在过去十年中,已经开发了许多越来越准确、快速、智能化的RACS集成技术用于分析单个细胞。RACS作为一种无标签的单细胞分选技术,为了解同基因细胞群体中的表型异质性和探索复杂细胞群体中的单细胞功能提供了新的研究方法,开辟一个新的细胞生物学的领域。尽管,现阶段对于单个细胞分选已达到了很高的准确率,但是自动化的分选速率还有待提高,这依赖于RACS与更精密的拉曼光谱仪、更先进的SERS技术相集成。更普适的RACS有望在未来适合所有环境样本的单细胞分析,对群体中细胞信号转导以及表型和基因型的联系有更好的解释,对于精准医疗和探索环境不可培养微生物意义重大。