七味育肝颗粒对肝纤维化大鼠的防治作用*

程小丽， 赵余珠， 王志旺△， 丁茂鹏， 韦凌霞， 潘 虹

((1.甘肃中医药大学, 兰州 730000; 2. 甘肃中医药大学附属医院, 兰州 730000)

肝纤维化是多种肝病过程中肝细胞外基质异常增生、沉积的病理过程[1]。在肝“体阴而用阳”、“阳常有余而阴常不足”等中医理论指导下，四川名中医朱正平教授提出补肝肾之阴血、散气血之瘀滞是治疗肝纤维化的基础治法，在上述中医理论的指导下，拟定七味育肝复方并制成颗粒剂(七味育肝颗粒，QYG)，在临床上取得了较好的疗效[2]。基质金属蛋白酶-13(MMP-13)具有降解纤维胶原的活性，而基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)是MMP-13的特异性抑制剂，MMP-13/TIMP-1失衡在肝纤维化过程中发挥重要作用[3]。本研究采用复合因素复制肝纤维化大鼠模型，观测QYG对肝纤维化的治疗作用，同时，从基质金属蛋白酶-13(MMP-13)/基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)失衡的角度探讨QYG抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

七味育肝颗粒(QYG)，由甘肃中医药大学药理教研室提供，批号：20171028。秋水仙碱，西双版纳版纳药业责任有限公司，国药准字H53021369，批号：20170904。丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase, AST)试剂盒是南京建成生物工研究所生产，批号：20180702、20180604；透明质酸(hyaluronic acid, HA)、Ⅲ型前胶原(Ⅲ procollagen, PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Type IV collagen, C-Ⅳ)ELISA试剂盒是北京北方生物技术研究所生产，批号：180403、180502、180401；基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)；基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)试剂盒是北京博奥森生物技术有限公司，批号：AD04205689、AH09264155。

1.2 仪器

高速冷冻离心机(TGL-16G型)，上海安亭科学仪器厂产品；分光光度计(722型)，上海第三分析仪器厂产品；光学显微镜(CH-212型)，日本奥林巴斯株式会社产品；医学图像分析系统(BI-2000型)，成都泰盟科技有限公司产品。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，♂♀各半，体质量200～230 g，中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供并进行实验，许可证号：SCXK(甘)2015-0001。

1.4 分组、造模并给药

将SD大鼠随机分为6组，即空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、秋水仙碱组(Colchicine, 1.0×10-4g/kg)、QYG药物干预组(QYG-H、QYG-M、QYG-L, 14.8、7.4、3.7 g/kg)，每组8只，雌雄各半。除空白对照组外根据预实验及文献复制肝纤维化模型[4]，采用皮下注射40%四氯化碳橄榄油(第1次5.0 ml/kg，后续每次3.0 ml/kg)，2次/周，连续6周；同时灌胃乙醇15 ml/kg(乙醇浓度第1周 5%、第2周10%、第3周15%、第4～6周20%)。空白对照组按上述方法皮下注射橄榄油、灌胃纯净水。从造模开始各治疗组按上述剂量灌胃给药15 ml/kg，1次/d，连续6周，空白对照组与模型对照组大鼠灌胃等体积纯净水。

1.5 观测指标

实验第43日麻醉大鼠，股静脉取血，分离血清测定肝功能(ALT、AST)。处死大鼠后取肝脏，于固定位置取肝组织2份，第1份肝组织经匀浆、离心，取上清液严格按照试剂盒说明书测定纤维化相关指标(HA、PCⅢ、C-Ⅳ)；第2份肝组织经多聚甲醛固定、切片，采用Masson染色和免疫组化染色，观察肝组织纤维化病理变化，对MMP-13、TIMP-1表达水平进行半定量分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 QYG对肝纤维化大鼠肝功能的影响

模型对照组大鼠血清ALT、AST显著升高，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01，表1)。在QYG的干预下，ALT、AST明显下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01)；随着剂量的增加，上述指标的下降更加明显，但QYG药物干预组之间的差异尚无统计学意义(P>0.05)。

Tab. 1 The effects of QYG on liver function in rats with hepatic fibrosis (U/L， n=8)

2.2 QYG对肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响

空白对照组大鼠的肝脏表面光滑、色泽均匀，模型对照组大鼠的肝脏表面呈浅黄色或黄褐色颗粒状，QYG各剂量组大鼠的肝脏出现不同程度的改善。肝组织Masson染色在光镜下如图1所示，空白对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐有序，肝小叶内纤维组织少见。模型对照组纤维组织充满视野，肝脏胶原纤维组织增生明显，纤维间隔增厚并连接成片，肝小叶结构破坏并形成大量假小叶，肝组织纤维化程度高。QYG各剂量组与模型对照组相比肝纤维化程度明显减轻，尤其是QYG高剂量组的改善作用更加明显，肝纤维组织沉积明显减少，纤维间隔变薄，局部肝细胞连接成片，肝小叶结构趋于完整。

Fig. 1 The effects of QYG on histopathology of liver in rats with hepatic fibrosis (Masson staining ×10)

2.3 QYG对大鼠肝纤维化相关指标的影响

模型对照组大鼠肝组织中HA、PCⅢ、C-Ⅳ显著升高，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01，表2)。在QYG的干预下，HA、PCⅢ、C-Ⅳ明显下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01)，但QYG药物干预组之间对上述指标的影响尚无统计学意义(P>0.05)。

2.4 QYG对肝纤维化大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1表达的影响

如图2、图3所示，MMP-13、TIMP-1免疫组化染色后在镜下以棕褐色为阳性表达，主要分布于肝细胞的胞质与胞浆中。模型对照组MMP-13、TIMP-1表达显著增加，MMP-13/TIMP-1显著降低，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01，表3)。在QYG的干预下，MMP-13、MMP-13/TIMP-1明显增加，而TIMP-1表达明显降低，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)；与QYG中剂量组比较，QYG高、低剂量组TIMP-1降低、MMP-13/TIMP-1增加的幅度更大(P<0.01)。

Fig. 2 The effects of QYG on the expression of MMP-13 in rats with hepatic fibrosis (×40)

Fig. 3 The effects of QYG on the expression of TIMP-1 in rats with hepatic fibrosis (×40)

Tab. 2 The effects of QYG on fibrotic indexes of hepatic tissue in rats (μg/L, n=8)

Tab. 3 The effects of QYG on MMP-13 and TIMP-1 of liver in rats with hepatic fibrosis n=8)

3 讨论

肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝组织对炎症损伤的修复反应，是多种慢性肝病的重要病理特征和发展至肝硬化的必经阶段。肝纤维化是可逆的，但发展为肝硬化就很难逆转，故抗肝纤维化治疗是防治慢性肝病发展至肝硬化的关键环节[5,6]，因此肝脏病理学家Hans Popper说“谁能阻止或延缓肝纤维的发生，谁就将治愈大多数慢性肝病”。中医理论认为肝“体阴”但“阴常不足”，肝病过程中病邪消耗肝之阴血，致使肝阴不足而相火妄动，进一步耗损阴血，故肝阴不足成为肝纤维化的基础病机；然淤血聚于肝经，血瘀之症成为临床常见症状，故阴虚血瘀是肝纤维化的主要矛盾[7]。在育阴化瘀、消癥软肝治则指导下拟定七味育肝复方并制成颗粒剂(QYG)，临床上对慢性肝炎、肝纤维化以及早期肝硬化有明显的疗效[2,8]。本次研究在饲以高脂饲料的基础上，利用四氯化碳与乙醇的肝毒性来复制肝纤维化动物模型，结果显示，QYG可明显降低血清ALT、AST，改善肝功能；在病理学研究中发现QYG可缓解肝组织病理学变化，抑制纤维组织异常沉积，肝纤维化相关指标肝组织中透明质酸、Ⅲ型前胶原及Ⅳ型胶原的水平亦相应的减低，其中QYG高剂量组的结果与阳性药物秋水仙碱的作用相似。上述结果为QYG临床治疗肝纤维化提高了实验依据。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是降解细胞外基质的水解酶，包括间质胶原酶、明胶酶以及基质分解素等，而MMP-13是目前已发现的唯一能降解纤维类胶原的酶类，在抗肝纤维化中有着重要意义[9]。基质金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)是MMPs的特异性抑制剂，而TIMP-1为MMP-13的抑制物，主要来源于肝星状细胞，通过抑制I型、III型胶原的降解而促进肝纤维化[3]。因此，MMP-13活性不足和/或TIMP-1异常激活导致MMP-13/TIMP-1失衡在肝纤维化过程中发挥关键作用[10]。本次研究结果显示，在QYG的干预下，MMP-13的活性升高、TIMP-1的活性降低，且QYG对TIMP-1、MMP-13/TIMP-1的影响有一定量效关系的趋势，提示改善MMP-13/TIMP-1的失衡状态是QYG抗肝纤维化的作用机制之一。