四逆散对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其机制*

赵家荣， 冯雪松， 李 宏， 王国全， 张艳芳， 史海龙， 李媛媛， 晁 旭,△

((1. 陕西中医药大学基础医学院， 咸阳 712046； 2. 陕西中医药大学第二附属医院， 咸阳 712000； 3. 陕西中医药大学药学院， 咸阳 712000)

肝癌是世界上第六大最常见的癌症，也是导致癌症死亡的第四大原因，截止到2018年，全球每年新增病例约84.1万，死亡782 000人[1]。研究表明，中医药可通过抑制肝癌细胞生长和增殖，诱导肝癌细胞凋亡和分化，抑制肿瘤血管生成，抗肝癌复发转移，逆转肝癌细胞耐药性，调节和提高机体免疫功能，调节细胞信号转导等环节达到治疗肝癌的目的[2]。

四逆散是治疗肝病的经典代表方，首见于张仲景的《伤寒论》，被后世赞誉为疏肝之祖方。该方由柴胡、芍药、枳实、炙甘草四味中药组成，主要用于治疗肝气郁结，阳气内郁，不能透达四肢的热厥证[3]。四逆散在临床上广泛用于治疗肝纤维化[4]、肝损伤[5]、肝硬化[6]、酒精性脂肪肝[7]和肝炎等[8]。

研究表明，四逆散在原发性肝癌的治疗中也发挥重要作用[9-10]，对延长原发性肝癌患者生存期、中位生存时间及控制瘤体有一定效果，可改善患者的症状，提高患者生存质量，改善肝功能[11]。但是，有关四逆散对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制的研究尚未见报道。

本研究以体外培养的人肝癌HepG2细胞为材料，研究含四逆散药液血清对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及分子机制，以期为临床上用四逆散治疗原发性肝癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞系

SPF级雄性SD大鼠购买于西安交通大学医学院实验动物中心(合格证编号：61001700002052)。人肝癌细胞HepG2细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2 药物与试剂

柴胡，白芍，枳实，炙甘草购买于陕西中医药大学第二附属医院中药房。五氟尿嘧啶(5-FU)由江苏恒瑞医药股份有限公司出品。RPMI 1640培养基购自美国Gibco生物技术公司。小牛血清购自四季青生物技术有限公司。MTT试剂盒、hochest33258染色试剂盒、Rho123染色液购自北京solarbio生物科技有限公司。二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑盐(MTT)，胰蛋白酶等试剂购自Sigma-Aldrich公司。

1.3 含四逆散药液血清的制备

四逆散药液制备：取柴胡(6 g)、白芍(6 g)、枳实(6 g)、炙甘草(6 g)药材加水10倍浸泡3 h，煎煮2次(第1次8倍量，第2次6倍量)，每次1 h，过滤分离药渣，保留药液。合并滤液，混匀，煎煮浓缩药液至600 ml，直至药液含生药终浓度为0.4 g /ml。

选择SPF级SD雄性大鼠(180～220 g)6只，分为空白血清组，四逆散0.4 g/ml组，每组3只。空白血清组给予蒸馏水灌胃，四逆散给予四逆散药液灌胃，连续灌胃3 d，每次2 ml，2次/日。末次给药后2 h,麻醉动物后，心脏取血。然后将血液常温静置2 h后，2 500 r/min(离心后切勿晃动)离心25 min，取上清，得到高浓度含四逆散药液血清。然后用空白血清将高浓度含四逆散药液血清稀释1倍，得到中浓度含四逆散药液血清；再用空白血清将中浓度含四逆散药液血清稀释1倍，得到低浓度含四逆散药液血清。

将所有的含四逆散药液血清置于56℃水浴锅中灭活30 min，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，然后储存于-80℃冰箱保存备用。

1.4 细胞培养与实验分组

HepG2细胞培养在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中(含100 U/L 青霉素和100 μg/ml链霉素)；在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养和传代。实验分为5组(n=3)：空白对照组(Control)、阳性对照组(5-FU)、四逆散低剂量组(SNS-L)、四逆散中剂量组(SNS-M)和四逆散高剂量组(SNS-H)。

1.5 MTT法检测细胞抑制率

将HepG2细胞以1×104cells/ml的密度接种于96孔板，每孔180 μl，每组设3个复孔。待细胞完全贴壁后，SNS-L、SNS-M和SNS-H组分别添加20 μl低、中、高浓度的含四逆散药液血清，空白对照组和阳性对照组分别加入20 μl空白血清和5-FU。继续置于细胞培养箱中培养48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，再培养4 h。然后小心地吸去培养液，再向每孔加入150 μl DMSO溶液，振荡混匀10 min，用酶标分析仪(雷杜RT-600)，在490 nm波长条件下检测各孔吸光值，并用以下公式计算抑制率：

抑制率(%)=(1- OD处理组/OD对照组)×100%

1.6 Hochest33258染色检测细胞凋亡

将各组HepG2细胞以2×106cells/ml的密度接种于6孔板，培养箱中过夜。药物作用48 h后，小心地吸去培养液，再加入0.5 ml固定液；固定10 min后，小心地吸去固定液，用PBS洗2遍。向每孔加入0.5 ml hochest33258染色液，染色5 min；然后弃去染色液，用PBS洗两遍；最后取1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片，封片后用荧光显微镜拍照。

1.7 细胞凋亡检测

将各组HepG2细胞以2×106cells/ml的密度接种于6孔板，培养箱中过夜，使细胞贴壁生长。药物作用48 h后，收集细胞，用PBS清洗两次。然后400 μl细胞悬液中加入400 μl结合缓冲液和10 μl AnnexinV-FITC(20 μg/ml)，混匀，4℃避光孵育15 min后，在细胞悬液中加入5 μl碘化丙啶(PI)(20 μg/ml)，混匀，4℃避光孵育5 min，室温放置10 min。采用流式细胞仪(BECKMAN COULTER)检测细胞凋亡率。

1.8 细胞周期检测

将各组HepG2细胞以2×106cells/ml的密度接种于6孔板中，培养箱中过夜。药物作用48 h后，收集细胞，用预冷PBS洗涤2次后，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4 h。然后1 500 r/min离心5 min，弃上清；再用预冷PBS洗涤1次，加入PI 400 μl和RNaseA 100 μl，4℃避光孵育30 min。经50 μm尼龙网过滤后，用流式细胞仪检测HepG2细胞周期。

1.9 线粒体膜电位检测

将各组HepG2细胞以2×106cells/ml的密度接种于6孔板，培养箱中过夜。药物作用48 h后，收集细胞，用PBS洗涤2次后，加入400 μl罗丹明123染液(5 μg/ml)。在培养箱中孵育10 min后，用培养基洗涤两次，流式细胞仪检测线粒体FSC、SSC(激发波长488 nm，发射波长530 nm)。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 含四逆散药液血清对HepG2细胞增殖和凋亡率的影响

含四逆散药液血清处理人肝癌HepG2细胞48 h后，用倒置显微镜观察细胞形态， MTT法检测细胞的增殖率。结果显示，与空白对照组比较，含四逆散药液血清处理后的HepG2细胞数量显著减少。细胞形态由边缘清晰的梭形，变圆、皱缩，甚至破裂(图1A)。MTT法检测结果表明，药物处理后各组细胞的抑制率显著增大(P<0.01)，空白对照组、5-FU组、SNS-L组、SNS-M和SNS-H组细胞的平均抑制率分别为2.97%，28.72%，26.90%，31.87%和37.90%。

如图1(B)所示，含四逆散药液血清处理HepG2细胞后，空白血清组，5-FU对照组，含四逆散药液血清低剂量组，中剂量组，高剂量组48 h的凋亡率随着浓度的增加而升高，分别为15.7%、19.6%、 20.0%、40.3%、46.3%；四逆散低剂量组与对照组比较无显著差异，中剂量组和高剂量组与对照组比较有明显差异(P<0.05)。

Fig. 1 Effect of SNS on cell morphology and apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells(n= 3)

2.2 含四逆散药液血清对细胞凋亡形态的影响

如图2所示，含四逆散药液血清处理HepG2细胞后，四逆散组与对照组细胞核差异显著。空白对照组细胞核形态完整，均匀分布，四逆散低、中和高剂量组细胞核皱缩，变圆，形成凋亡小体。

Fig. 2 Apoptosis of hepatocellular carcinoma cell detected through Hochest33258 stain

2.3 含四逆散药液血清对人肝癌HepG2细胞周期和线粒体膜电位的影响

如图3A所示，含四逆散药液血清处理的HepG2细胞48 h后，空白血清组、5-FU组，四逆散低、中和高剂量组G1期细胞的百分比随着浓度的增加而升高(P<0.05)，分别为67.5%、72.95%、71.97%、79.72%、81.75%；G2期细胞的百分比分别为5.66%、4.21%、4.50%、3.34%和1.43%。该结果表明含四逆散药液血清处理的HepG2细胞被阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖。

HepG2细胞经处理48 h后，空白对照组、5-FU组、含四逆散药液血清低、中和高剂量组的线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，分别为156.21%、 151.86%、140.52%、111.41%、107.57%，提示含四逆散药液血清可能通过破坏线粒体膜电位，诱导HepG2细胞凋亡(图3B)。

Fig. 3 Effects of SNS on cell cycle and mitochondrial membrane potential of hepatocellular carcinoma HepG2 cells(n= 3)

2.4 含四逆散药液血清对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

如图4A所示，人肝癌HepG2细胞经含四逆散药液血清处理后，与空白对照组相比，5-FU组、含四逆散药液血清中和高剂量组Bax的表达显著升高(P<0.05)，bcl-2的表达显著降低(P<0.05)。经含四逆散药液血清处理后，5-FU组、含四逆散药液血清中和高剂量组Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c的蛋白表达均显著增高(P<0.05)。

Fig. 4 Effects of SNS on the expression levels of proteins related to apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cell(n= 3)

3 讨论

由于人肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发病隐匿，大多数患者在确诊时已处于晚期，发生了转移, 只有三分之一的确诊肝癌患者可以进行手术切除、射频消融、肝移植等治疗[12]。目前，对于不能手术治疗的晚期肝癌，其中全身化疗是其治疗的重要手段之一。但是大多数化疗药都选择性差，毒副作用大而且容易产生耐药性，因此，寻找高效、低毒、选择性强的天然抗肿瘤药物很有必要[13]。中医药是中国肿瘤治疗中的一大特点，在肿瘤治疗过程中发挥着重要意义[14]。

肝癌在我国古代文献中可归属于“鼓胀”、“肥气”、“黄疽”、“积聚”、“肝积”等病证的范畴；《医宗必读》有云:“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”中医对肝癌的认识，目前多数医家认为本病属因虚致实，虚实夹杂，本为正气不足，标为邪毒内发。正气亏虚而致脏腑阴阳失调、气机不畅，痰浊、瘀血、毒邪相互搏结，久积于肝而发为肝癌。临证上多以培正固本、清热解毒、祛瘀活血、消痰散结等治则为主。四逆散是治疗肝病的经典代表方，其主治胁肋胀闷，脘腹疼痛的肝脾气郁证。《伤寒论·辨少阳病脉证并治》中记载：“少阴病，四逆，其人或咳，或悸，或小便不利，或腹中痛，或泄利下重者，四逆散主之”。四逆散由柴胡，芍药，枳实，炙甘草四味中药组成，共奏透邪解郁，疏肝理脾之效，使邪祛郁解，气血条畅，清阳得升，四逆自愈。

本研究结果显示，含四逆散药液血清具有抑制HepG2细胞增殖的作用，且随着剂量的增大而增强。人肝癌HepG2细胞经含四逆散药液血清处理后，细胞数量显著减少，细胞核呈现典型的凋亡形态。细胞周期结果显示，经含四逆散药液血清处理后，G1期细胞数明显增加，而G2期细胞数量减少。以上结果提示，含四逆散药液血清可能是通过阻滞肿瘤细胞滞留于G1期，抑制肝癌细胞的增殖。

研究表明，线粒体通过向释放细胞膜间隙活化半胱天冬酶而在细胞凋亡中发挥关键作用[15]。细胞的线粒体凋亡是由于Bcl-2家族促凋亡基因Bax/Bak与抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL水平之间的平衡失调导致的[16]。Bcl-2/Bax失调引起线粒体内Cyt-c释放，进而激活Caspase-9的表达，激活Caspase-3，最终诱发细胞凋亡[17]。Caspase 家族是细胞凋亡过程中起着调节和执行作用的重要枢纽，Caspase 的异常变化提示细胞凋亡水平的改变[18]。本研究结果显示，含四逆散药液血清处理HepG2细胞凋亡率显著增加，线粒体膜电位显著下降。Western blot结果表明，含四逆散药液血清处理HepG2细胞后，Bax、Caspase-3、-9和Cyt-c的表达显著升高，而Bcl-2的表达显著降低。以上结果表明，四逆散可能通过线粒体途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。

本研究结果表明含四逆散药液血清可以抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。但是，其中通过线粒体途径诱导细胞凋亡途径的成分尚需进一步研究。