抗阻运动对胰岛素抵抗小鼠海马内焦亡相关蛋白的影响*

姬瑞方, 卞学鹏, 刘蓓蓓, 胡静芸, 薛香莉 , 娄淑杰△

((1. 上海体育学院， 上海 200438； 2. 潍坊医学院， 山东 潍坊 261042)

高脂膳食可诱发多种代谢紊乱，例如肥胖、高血压、胰岛素抵抗、2型糖尿病和胰岛素抵抗[1]，其中胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是指脂肪细胞、神经元、骨骼肌等靶细胞对正常循环水平的胰岛素反应降低[2]，使胰岛素信号传导发生障碍，继而诱发氧化应激、氮化应激和内质网应激等多种细胞应激。前人研究表明氧化应激和内质网应激等可以激活NOD样受体蛋白3(NOD like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体，引发细胞焦亡[3]。细胞焦亡是一种程序性促炎死亡方式，通常认为参与机体防御病原体的免疫机制消皮素D(gasdmermin D，GSDMD)是细胞焦亡的执行蛋白，其蛋白上切割位点以及N端的完整性是焦亡发生的必要条件[4]。

NLRP3炎症小体由NLRP3、接头蛋白ASC及半胱氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)组成，参与Caspase-1依赖性经典焦亡途径。其中NLRP3蛋白可感知细胞内的代谢变化和危险分子，例如真菌、细菌或病毒的感染以及线粒体氧自由基增多、细胞体积改变和钾离子外流等[5]；接头蛋白ASC具有信号放大的作用可同时招募Caspase-1[6]。被招募的Caspase-1通过自切割形成活性形式的Caspase-1，可直接切割原本处于自身抑制状态的GSDMD的N端和C端的连接，N端和C段的断裂使GSDMD的自身抑制状态解除，GSDMD的N端结构域(GSDMD-N)转移到细胞膜与膜上的膜磷脂、磷酸肌醇和双磷脂酰甘油结合后形成孔洞，细胞内容物释放，引起细胞焦亡[7]。同时活性形式的Caspase-1对白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)的前体进行切割，成熟形式的IL-1β和IL-18通过孔洞释放。

本课题组前期研究表明胰岛素抵抗状态下海马内糖代谢紊乱，三羧酸循环受阻导致海马内腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)不足[8]。腺苷酸活化蛋白激酶((AMP)-activated protein kinase, AMPK)与沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)是细胞的能量感受器，其活性受到海马中异常糖代谢影响。而AMPK和SIRT1同时可参与炎症反应，通过调控核转录因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)去乙酰化降低其转录活性，减少NLRP3炎症小体、IL-1β和IL-18等炎症因子转录[7,9,10]。

研究表明，胰岛素抵抗发生时，在外周组织例如肝[11]、白色脂肪组织和骨骼肌[12]等部位均有细胞焦亡现象的发生，但脑内特别是海马组织是否发生细胞焦亡尚未可知。适量运动和合理膳食是促进2型糖尿病患者康复，减轻胰岛素抵抗的有效措施[13]。而抗阻训练可通过提高肌肉线粒体质量和促进骨骼肌肥大，改善胰岛素反应性和脑内葡萄糖代谢[14]。但抗阻运动能否改善胰岛素抵抗小鼠海马内的细胞焦亡仍未可知。

因此，本实验利用高脂膳食建立IR小鼠模型，考察外周胰岛素抵抗对海马细胞焦亡的影响，并探究抗阻训练的调节作用，从而揭示抗阻训练对胰岛素抵抗小鼠海马功能的改善作用，为运动促进脑健康提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6周龄雄性C57BL/6J小鼠38只(购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司)饲养于上海体育学院动物房。小鼠自由摄食和饮水，光照比12 h∶12 h，动物房温度(22±2)℃，相对湿度40%～70%。小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组(C,n=12)和高脂饲料组(HFD,n=26)。C组喂养普通饲料，HFD组喂养高脂饲料(60 %脂肪供能，D12492)。

喂养12周后，C组和HFD组小鼠进行葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test, GTT)以及胰岛素耐量实验(insulin tolerance test, ITT)。GTT实验中小鼠禁食16 h后按照2 g/kg体重腹腔注射50%浓度的葡萄糖溶液，此后0、15、30、60、90、120 min时于尾静脉取血测小鼠血糖浓度；ITT实验禁食6 h后以1 U/kg体重腹腔注射胰岛素溶液，于0、15、30、60、90、120 min时尾静脉取血测小鼠胰岛素浓度。根据实验数据，统计结果及绘制曲线，以实验结果C组小鼠和IR组小鼠的胰岛素和葡萄糖曲线下面积具有显著性差异判定胰岛素抵抗模型成功建立。将建模成功的HFD组小鼠随机分为胰岛素抵抗组(IR,n=10)和胰岛素抵抗+抗阻运动组(RT,n=10)，继续进行高脂饲料喂养。

1.2 实验试剂和仪器

兔源抗体NLRP3、ASC、NF-κB、SIRT1、AMPK、p-AMPK购自Cell Signaling Technology公司，兔源抗体IL-1β、IL-18、GSDMD购自abcam公司，鼠源抗体Caspase-1购自Santa公司，β-Actin、β-Tubulin、辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗、辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自proteintech公司。彩色预染蛋白质分子量标准购自Thermo Scientific公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自上海威奥生物科技有限公司。BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)及PVDF膜购自Millipore公司。蛋白质电泳仪、蛋白质转膜装置购自美国BioRad公司。

1.3 抗阻运动训练方案

RT组小鼠经1周适应性运动后，进行抗阻运动。运动方案如下：

小鼠进行负重爬梯抗阻训练12周。爬梯高度为1 m，与地面倾斜成85°，梯级间隔为2 cm。初始负重强度为小鼠自身体重的30%，并逐渐递加负荷，前4周每周增加10%体重，第五周増至80%体重，此后每两周增加10%体重。每周训练3 d，每天训练3组，每组训练5次，次间隔1 min，组间隔2 min，采用毛刷轻轻刺激小鼠尾部使小鼠完成15次抗阻运动或者达到力竭停止运动[15]。

1.4 实验动物取材与样本制备

12周抗阻运动结束后，小鼠隔夜禁食，10%的水合氯醛麻醉后处死。于冰上迅速剥离脑组织并分离海马，储存于EP管中，迅速置于液氮中冷冻。随后将海马组织剪碎并提取海马全组织蛋白，利用BCA法检测蛋白浓度，根据浓度测定结果，加入相应量蛋白上样缓冲液(5X)和PBS，将样本浓度调成5 μg/μl，蛋白上样缓冲液同时被稀释成1X，在95℃水浴锅中进行5 min的蛋白变性，随后转移至-80℃冰箱保存。

1.5 Western blot蛋白免疫印迹实验

利用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，5% BSA-TBST中封闭1 h。一抗孵育，4℃过夜。次日用TBST洗膜3次，加入相应二抗，室温摇床孵育1 h，然后用TBST洗膜3次。最后加入ECL化学发光试剂(Millipore，USA)反应3～5 min，曝光10 s～5 min，显影2 min后定影。条带用Image J软件进行分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 胰岛素抵抗小鼠的建模结果

如图1所示，C组和HFD组小鼠GTT曲线均随时间的推移呈先上升后下降的趋势，且血糖峰值均出现在15 min左右，但HFD组的血糖值均始终高于C组，即HFD组小鼠葡萄糖耐量减低。同时，ITT曲线均随时间的推移呈下降后上升的趋势，且C组血糖始终高于HFD组，表明胰岛B细胞的合成和分泌功能受阻。GTT曲线下面积可用来评估机体葡萄糖耐受能力，ITT曲线下面积反映胰岛素靶器官对于胰岛素的敏感性。结果显示，HFD组小鼠GTT、ITT曲线下面积均显著性高于C组(P<0.05)。上述结果表明，12周的高脂膳食可诱导小鼠胰岛素抵抗的发生，模型建立成功。

Fig. 1 Glucose tolerance test and insulin tolerance test in each group of mice

2.2 运动干预前后各组小鼠海马内NLRP3炎症小体及其相关蛋白的表达情况

小鼠海马内NLRP3炎症小体包括NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白，其中NLRP3为感受信号蛋白，ASC为接头蛋白，招募Caspase-1组成炎症小体，进一步调控下游焦亡相关蛋白。如图2所示，IR组小鼠海马内的NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白水平均显著高于C组(P<0.05)，而经过12周的抗阻运动后，ASC、Caspase-1的表达水平均显著下降(P< 0.05)。

2.3 运动干预前后小鼠海马内焦亡相关蛋白的表达情况

GSDMD是经典细胞焦亡途径中Caspase-1的下游蛋白，可切割出GSDMD的N端用于和胞膜磷脂等结合在胞膜形成孔洞。同时Caspase-1可切割IL-1β和IL-18的前体，释放成熟形式的IL-1β和IL-18。如图3所示，IR组小鼠海马内GSDMD(P< 0.01)、GSDMD-N(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)、IL-18(P<0.05)的蛋白表达量均显著高于C组，而12周的抗阻运动后，RT组小鼠海马内GSDMD(P< 0.05)、GSDMD-N(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)、IL-18(P< 0.05)的蛋白表达量较IR组显著性降低。

Fig. 3 The expressions ofpyroptosis-related proteins in the hippocampus of each group of n=8)

2.4 运动干预前后小鼠海马内p-AMPK/AMPK、SIRT1、NF-κB的表达情况

NLRP3炎症小体的表达水平主要受核转录因子NF-κB的调控，而细胞能量状态感受器AMPK和细胞氧化还原状态感受器SIRT1可协同抑制NF-κB的表达。为进一步明确胰岛素小鼠海马内NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡情况与AMPK和SIRT1的关系，我们检测了海马内p-AMPK/AMPK、SIRT1和NF-κB的蛋白水平。如图4所示，IR组小鼠海马内AMPK磷酸化水平和SIRT1表达量较C组显著下降(P<0.05)，而NF-κB较C组明显升高(P< 0.01)；12周的抗阻运动后，RT组小鼠海马内p-AMPK水平和SIRT1蛋白较IR组明显升高(P< 0.01)，NF-κB较IR组明显降低(P<0.05)。

3 讨论

细胞焦亡作为一种促炎程序性死亡方式，可分为Caspase-1依赖性焦亡途径和非Caspase-1依赖性焦亡途径[16]。焦亡发生时，细胞出现肿胀和膜成孔现象，伴随着细胞内容物释放，从而引发炎症反应。GSDMD蛋白是细胞焦亡的标志性产物，其GSDMD的N端结构域具有固有的细胞焦亡诱导活性[17]。适度的细胞焦亡可参与机体抵御感染的免疫反应，过度的细胞焦亡会引起免疫性疾病和脓毒性休克[18]。本研究发现，胰岛素抵抗小鼠海马内细胞焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-N有显著性的升高，提示在胰岛素抵抗小鼠海马内发生细胞焦亡。

Fig. 4 The expressions ofp-AMPK/AMPK, SIRT1 and NF-κB in the hippocampus of each group of n=8)

Tab. 1 Comparison of the expressions of proteins in the hippocampus of each group of mice by Western n=8)

研究表明，细胞焦亡过程中胞内容物的释放可以诱发炎症反应[6]。本研究结果显示，IR组小鼠海马内NLRP3、Caspase-1、ASC等炎症小体构成蛋白的蛋白表达量以及下游炎症因子IL-1β和IL-18的蛋白表达水平均显著增多，这与Zhai等[19]人的研究结果相似：db/db小鼠焦虑和抑郁样行为加重，学习和记忆功能受损，伴随着小鼠海马中NLRP3、ASC和IL-1β蛋白表达量显著上升，Caspase-1的活性明显上升。上述结果说明胰岛素抵抗小鼠海马内NLRP3炎症小体激活，促进炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达，这与细胞焦亡标志物GSDMD-N和GSDMD的增多相一致。

葡萄糖和糖原是大脑的主要能源底物，前期研究表明，大鼠发生胰岛素抵抗发生时，海马细胞内葡萄糖代谢障碍，主要表现为三羧酸循环水平下降，糖酵解途径、多元醇通路和磷酸戊糖途径激活，脑内ATP相对不足，AMP/ATP升高[20]。 AMPK是细胞内能量状态感受器，其活性受AMP/ATP的调节。SIRT1是依赖于NAD+的去乙酰化酶，除去乙酰化组蛋白外，还可作用于NF-κB在内的多种转录因子，与衰老、炎症、氧化应激等多种生理病理密切相关[9]。SIRT1和AMPK可以增强彼此作用，共同抑制NF-κB介导的炎症信号传导[21]。

本研究中，IR组AMPK蛋白磷酸化与SIRT1蛋白表达量均显著性降低，NF-κB蛋白表达量显著性增多，这提示胰岛素抵抗小鼠海马内AMPK与SIRT1对NF-κB抑制作用减弱，NLRP3炎症小体的激活，继发细胞焦亡和炎症反应。

目前国内外针对运动影响细胞焦亡的研究较少，尤其是抗阻运动对胰岛素抵抗小鼠海马内细胞焦亡的影响尚未见报道，但有学者关注药物对细胞焦亡的调控作用。例如Lin等[22]人利用番石榴汁和海藻糖抗炎、抗氧化、抗糖尿病的特性，补充番石榴汁和海藻糖可以减轻T2DM模型大鼠肾和胰腺的细胞凋亡，细胞焦亡和自噬。此外，Fan等[23]发现另有研究表明，气体吸入异氟烷的老年小鼠海马内NLRP3炎性小体激活并检测到GSDMD-N表达显著性增多，而气体吸入同时腹腔注射NLRP3炎性小体的抑制剂MCC950后发现，小鼠海马组织中GSDMD-N表达显著性减少。上述研究提示NLRP3炎症小体是改善细胞焦亡，减轻炎症反应的有效靶点。

结果显示，12周抗阻训练可使胰岛素抵抗小鼠海马内NLRP3、Caspase-1、ASC等蛋白减少，且焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-N以及炎症因子IL-18、IL-1β等蛋白表达量也有显著性的下降，提示抗阻运动可有效地缓解海马内炎症反应和细胞焦亡。这可能是因为抗阻运动改善小鼠海马的异常代谢，促进AMPK磷酸化程度和SIRT 1蛋白表达量，抑制NF-κB表达，进而阻碍NLRP3炎症小体的激活。而12周抗阻运动后，GSDMD以及GSDMD-N的表达量均显著性下降，这提示抗阻运动有效缓解细胞焦亡。GSDMD蛋白N端片段可转移至胞膜结合磷脂等物质致使胞膜成孔，标志细胞焦亡的发生。目前仍不清楚GSDMD蛋白N端片段减少是抗阻运动减少GSDMD总蛋白表达量所致，还是抗阻运动抑制GSDMD蛋白自切割现象所致。

综上所述，本研究发现胰岛素抵抗小鼠的海马内发生细胞焦亡和炎症反应。而12周的抗阻运动可增加AMPK与SIRT1的活性，抑制NF-κB表达和NLRP3炎症小体的激活，从而减少焦亡相关蛋白和炎症因子的表达，进而调控细胞焦亡和炎症反应，提示抗阻运动可有效改善胰岛素抵抗小鼠海马内细胞焦亡和炎症反应，从而促进海马结构和功能的稳定，为运动促进脑健康提供新的参考依据。