肿瘤内皮细胞标志物1在卵巢癌诊疗中作用的研究进展

鲍会静，徐晨

卵巢癌是最为常见的一种妇科恶性肿瘤，由于其发病隐匿，临床症状、体征不典型且缺乏有效的早期诊断方法，因此，80%的卵巢癌患者在确诊时已属晚期，晚期卵巢癌的5年生存率不到30%；同时大部分患者在接受传统放化疗后，不可避免地出现药物抵抗，且易复发，这使卵巢癌成为死亡率最高的妇科肿瘤。有研究报道，2012年全球新增卵巢癌病例共225 500例，死亡140 200例[1]。但是如果可以早发现，90%的Ⅰ期患者可以治愈，70%局限于骨盆的Ⅱ期患者生存率显著提高，同时计算机模拟表明，早发现可以整体提高10%～30%的生存率[1-2]。但是，目前无论是检测方法还是治疗手段均十分局限，亟需发掘新的特异性肿瘤标志物。

肿瘤标志物是由肿瘤组织产生或肿瘤组织刺激宿主产生，高于正常含量的一类能反映肿瘤发生、发展过程的物质，能早期诊断肿瘤且具有器官特异性，随着蛋白质组学、基因组学和代谢组学技术的发展和应用，已发现了大量与卵巢癌相关的肿瘤标志物，在卵巢癌的诊断中发挥重要作用。目前，CA125是最常用的卵巢癌血清肿瘤标志物，由于其表达水平受月经周期及妊娠等其他因素的影响，其敏感度虽高，但特异度不强，假阳性率较高。此外，人附睾蛋白4（HE4，又名WFFDC2）、CA19-9、甲胎蛋白（AFP）及癌胚抗原（CEA）均可作为辅助诊断卵巢癌的肿瘤标志物[3]。已有研究显示，与单独使用CA125相比，联合HE4检测可以降低18%的漏诊率[4]。

近期研究发现肿瘤组织中表达肿瘤内皮细胞标志物（tumor endothelial marker，TEMs），而TEMs在正常组织中少量表达或不表达，能够成为良好的肿瘤标志物。TEM1（又称为Endosialin或CD248）属于TEMs家族，首次被发现表达在与肿瘤血管相关的周细胞和成纤维细胞上，随后有研究证明TEM1在卵巢癌组织中高表达[5]。这为卵巢癌的诊断及治疗提供了新的靶点。

1 TEMs的发现及结构

2000年Croix利用SAGE技术比较胃癌患者及正常人的胃黏膜细胞中基因表达量差异，并发现43种基因在肿瘤细胞中有较高特异性表达而在正常细胞中不表达或低表达，随后这些基因被命名为TEMs。紧接着，学者们在啮齿动物与哺乳动物中对TEMs家族的结构及功能进行了进一步的研究，揭示了人类TEM1、TEM5、TEM7和TEM8的具体空间结构。同时SAGE实验结果显示，与其他肿瘤内皮标志物相比，TEM1在肿瘤及正常组织中的表达差异最大[5]。

TEM1包含757个氨基酸，其分子质量大小为80.9 ku，在染色体上定位于11q13。TEM1属于单次跨膜糖蛋白，大部分（685个氨基酸）在细胞外侧，包含1个C型凝集素样域、1个Sushi域、3个表皮生长因子（EGF）样域及1个mucin样区；细胞内、外部分通过一段跨膜蛋白相连，且细胞内部分较短，仅含51个氨基酸。TEM1与CD141、CD93同属于血栓调节素家族，在分子结构上均含有C型凝集素，是表达在细胞表面的糖蛋白，后两者分别具有抗凝作用与介导细胞吞噬作用[6]。最近研究发现，该糖蛋白家族成员还包含CLEC14A，其主要定位于内皮细胞，参与细胞间的粘连以及肿瘤血管的生成[7]。多聚体2（multimerin 2，MMRN2）是一种内皮选择性细胞外基质蛋白，参与血管生成和肿瘤进展，最新的研究显示CLEC14A、CD93和TEM1能够与MMRN2结合，此过程依赖于C型凝集素结构域中的一个长环区域，并通过该结构域中的突变而消除。当CLEC14A和CD93与非糖基化的MMRN2螺旋区结合时，TEM1与MMRN2的另一结构域结合。CLEC14A和TEM1可在人胰腺癌内皮细胞和周细胞界面同时与MMRN2结合。MMRN2的重组肽能阻断CLEC14A与内皮细胞的结合，在体外具有抗血管生成作用，在小鼠体内可以减缓肿瘤生长[8]。

2 TEM1的表达

学者们曾认为TEM1仅表达于肿瘤内皮细胞及纤维母细胞上，然而随后发现在胚胎发育过程中，多种器官（如肝、脾、肾等）的血管内皮细胞上也有TEM1表达，且随着胚胎的发育，TEM1的表达量逐渐下降。在发育成熟的组织中，子宫及肾小球中TEM1表达较高，输卵管也有少量表达，心、肺中的表达更低，在其他组织中则几乎不表达[9]。而在肿瘤组织中，TEM1则高表达于肿瘤微血管周细胞上。

CD31是公认的内皮细胞标记，NG2是公认的周细胞标记。Ozerdem等[10]利用CD31和CD248/TEM1双标免疫荧光染色及CD31和NG2双标免疫荧光染色来明确TEM1的分布，结果表明CD248/TEM1阳性细胞与NG2阳性细胞均位于血管外侧相同的位置，而与CD31阳性细胞分布不同。Simonavicius等[11]也通过双标免疫荧光染色进一步明确了TEM1高表达于肿瘤血管的周细胞，而并非肿瘤血管内皮细胞。Matsushima等[12]研究发现，在细胞外基质中，纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原是CD248的特异配体，两者结合后能促进细胞的黏附和迁移。TEM1与纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原结合后，能促进细胞分泌基质金属蛋白酶9（MMP-9），降解细胞外基质，利于细胞的迁移和黏附。肿瘤细胞产生的Mac-2BP/90K能特异地与TEM1结合，进而降低肿瘤细胞与肿瘤间质的黏附作用。Nanda等[13]发现敲除腹部肿瘤模型小鼠TEM1基因后不会对其胚胎发育产生影响，同时肿瘤体积减小，转移能力下降。还有研究发现，在乳腺癌中，TEM1表达与肿瘤的浸润、预后相关，TEM1表达升高，肿瘤浸润能力增强，预后差；在胶质瘤中，TEM1高表达意味着肿瘤级别更高，预后更差。在直肠癌中，TEM1的表达与肿瘤进展相关[14]。

3 TEM1在卵巢癌诊断及治疗中的研究进展

TEM1最早发现于肿瘤血管相关的周细胞和肌成纤维细胞中，之后在多种肿瘤的内皮细胞中均发现了TEM1的表达。2005年，Conejo-Garcia等[15]首先发现由卵巢癌分离得到的血管白细胞（vascular leukocytes，VLCs）在mRNAs水平高表达TEM1。2008年Christian等[16]发现在卵巢癌患者的组织切片中同样具有TEM1蛋白的表达，同年，Rouleau等[17]发现卵巢癌组织中表达的TEM1主要来自于肿瘤相关的血管，并且TEM1还可以促进肿瘤血管生成因子释放[18]，在肿瘤的发展中具有独特的作用。

3.1 TEM1在卵巢癌诊断中的研究进展 卵巢癌影像学诊断主要包括超声、计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和正电子发射计算机断层扫描（PET-CT）。传统的影像学诊断有一定的局限性，极易受到病变密度、机器灵敏度等多种因素影响发生漏诊的情况。将卵巢癌的肿瘤标志物与传统的影像学诊断相结合，可以弥补各自的不足。1999年美国哈佛大学 Weissleder最早提出分子影（成）像学（molecular imaging，MI）的概念，即应用影像学的方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。在诊断方面，通过对肿瘤发生过程中的关键标记分子进行成像，可在活体内直接观察到疾病起因、发生、发展等一系列的病理生理变化和特征，而不是仅仅显示疾病晚期的解剖改变。TEM1在肿瘤相关微血管周细胞、肿瘤相关基质细胞和间充质来源的恶性细胞上表达，人源化抗TEM1的单克隆抗体ontuxizumab（MORAb-004）已被应用于临床前和临床研究中。动物实验显示，将89Zr与ontuxizumab连接制备靶向探针可显著提高肿瘤细胞对89Z的摄入，进而提高PET的显像效果[19-22]。Yuan等[21]所选的特异性靶向TEM1的Fc融合蛋白标记的纳米粒子再与TEM1阳性细胞结合后迅速内化，进入到细胞内部，进而使其所携带的物质在肿瘤细胞内富集。

3.2 TEM1在卵巢癌治疗中的研究进展 近年来，越来越多的学者在肿瘤的诊断及治疗中采用抗体靶向作用的策略，美国FDA已批准了为数不少的高特异性单克隆抗体（mAbs）应用于临床。而更多由单克隆抗体衍生的小分子片段，如单链抗体（single chain Fv，scFv）等，具有更优秀的潜在利用价值。随着人源抗体库的不断完善以及抗体设计方法的不断优化，利用抗体靶向作用的检查及治疗能更好地满足临床广泛及多元化的实际需求。2014年，Li等[23]利用能够与TEM1特异性结合的单链抗体scfv78制备荧光探针，直接对卵巢癌模型小鼠进行活体成像观察，发现荧光探针除了在TEM1表达低的组织处有少量的分布外，只在高表达TEM1的卵巢癌肿瘤细胞上大量分布。该研究还发现此荧光探针在卵巢癌肿瘤细胞的示踪方面也有良好表现，提示TEM1在卵巢癌的诊断及治疗领域具有良好的应用前景。Matthaiou等[24]利用TEM1的特异性抗体进行设计，将其与包含在纳米颗粒内部的紫草素结合后加入卵巢癌肿瘤组织细胞中培养，研究发现包含紫草素的纳米颗粒由于TEM1抗体的作用能较好地定位到TEM1阳性的肿瘤细胞上，并对肿瘤细胞起到杀伤作用。利用靶向TEM1抗体的给药策略能在很大程度上减少药物衰减效应，同时一定程度地消除肿瘤细胞的逃避机制，对肿瘤细胞起到直接杀伤作用。Zhang等[25]为了提高贝伐单抗（BVC）对卵巢癌的治疗效果和细胞内浓度，设计了特异性靶向TEM1的二氧化硅纳米颗粒，研究结果显示，靶向TEM1的策略可有效增加OVCAR-5卵巢癌癌细胞对BVC的摄取和细胞内分布，抗癌效果良好。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T） 是应用基因工程技术使T细胞含有以肿瘤抗原为靶点的嵌合抗原受体（CAR），并依赖于该受体特异性识别肿瘤抗原的机制将已激活的T细胞靶向结合到肿瘤细胞上，从而达到对肿瘤细胞的杀伤作用[26-27]。TEM1同样被认为是一种较好的卵巢癌肿瘤抗原，目前已有的临床试验主要是针对人源化抗TEM1的单克隆抗体ontuxizumab（NCT01748721；NCT00847054）的，但是相信在不久的将来针对于靶向TEM1的策略的CART临床试验也会出现。

4 结语和展望

卵巢癌是一种具有高死亡率的女性生殖系统恶性肿瘤。由于其发病隐匿，临床症状、体征不典型，诊断方法较为局限。同时卵巢癌易复发，肿瘤细胞对传统治疗方式的耐药率高，存在弊端。因此，寻找针对卵巢癌的新型诊断及治疗途径具有极其重要的意义。TEMs是近年发现的一组能区分肿瘤组织与正常组织的新型肿瘤特异性标志物。TEM1作为其中之一已被证实能特异性表达在卵巢癌细胞上，且不表达或仅低表达于正常组织中。针对TEM1的特异性抗体，结合影像学技术能够使显影剂在肿瘤细胞内富集，使其具有较好的成像效果，因此对卵巢癌的发展及转归起到良好的监控作用；利用TEM1特异性抗体结合基因工程学及药代动力学对其加以改造，显示出了极好的抗肿瘤效果。依赖于靶向TEM1的CAR-T卵巢癌临床研究同样显示了较好的治疗效果。虽然TEM1的具体功能尚未完全阐明，但其组织分布和癌病发生后的病理性上调的清晰模式以及在细胞表面的表达，使其成为潜在的生物标志物、显像剂靶点和治疗靶点。尽管目前还没有特异性针对TEM1的研究药物获得临床准入，但是大量基于靶向TEM1的临床试验仍在进行中。相信在不久的将来，TEM1对卵巢癌诊疗的作用会越来越重要。