体外激活治疗早发性卵巢功能不全的作用机制及进展

尹兰兰，汪晨曦，马天仲

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是育龄妇女常见的疾病之一。在POI患者中，卵巢功能随着年龄的增长而下降，其特征是卵泡数减少和月经周期停止。POI的总患病率为1%，其中绝经后妇女的患病率为3.7%[1]。目前，POI患者有效的生育治疗方法是利用年轻女性的卵子进行体外受精和胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET），然而在我国因卵子来源受限和伦理等问题难以开展。近年来，基于Hippo通路和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路对卵巢始基卵泡的重要调控作用，卵巢皮质片的体外激活（in vitro activation，IVA）方法为POI患者的不孕不育提供了新的治疗技术。本文旨在简述在IVA技术中PI3K-AKT和Hippo信号通路对始基卵泡激活的调控作用，并综述IVA治疗POI的现状及研究进展。

1 POI

POI是指患者发生在40岁以前的卵巢功能丧失，以月经紊乱（闭经或少经）、卵泡刺激素（FSH）水平升高和雌二醇（E2）水平降低为特征并伴有不同程度围绝经期表现的临床综合征。2016年欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）提出POI的诊断标准是：①少经或闭经4个月以上；②连续2次检查（间隔＞4周）FSH＞25 U/L[2]。POI是一种有多种病因的综合征，其可能涉及的发病因素有遗传（X染色体及常染色体的突变等）[3]和自身免疫因素[4]等。此外，医源性因素（卵巢手术、放化疗干预）也可能导致POI。实际上对于大多数表现为POI的患者，其发病因素仍无法解释[5]。POI患者可通过激素替代治疗改善提前出现的围绝经期症状（闭经和低雌激素状态）[6]。对于有生育要求的患者，可实施早期诊断、提前保护，采用个体化的激素疗法以及促排卵、卵子冷冻技术和IVF-ET等措施。研究表明，部分被诊断为POI患者的卵巢皮质中仍保留着一定数目不受促性腺激素调控的处于休眠状态的始基卵泡。所以，该部分POI患者不能或很难通过常规的辅助生殖技术获得成熟可受精的高质量卵子[7]。因此，激活休眠的始基卵泡生长发育，获得成熟的卵子用于辅助生殖技术将成为保存POI患者生育力和成功妊娠的新方法。而如何激活始基卵泡则需要从调控卵泡发育及成熟的机制入手。

2 调控始基卵泡激活的通路

女性的基本生殖单位是卵泡，可以认为卵巢储备是由出生时的始基卵泡组成的一个固定池，在卵泡激活或闭锁的过程中逐渐减少。卵泡在卵巢内精密有序的发育、成熟过程是高度连续、完整的。始基卵泡形成以后，在一定时期内仅有一小部分始基卵泡进入生长发育阶段，经过始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡，最后发育为成熟的排卵前卵泡。其余大部分始基卵泡可以在卵巢内处于休眠状态并持续数十年。始基卵泡激活就是始基卵泡向初级卵泡转化的过程，分为两个阶段：首先围绕在初级卵母细胞周围的前体颗粒细胞增殖，形态由单层梭形转化为立方上皮；然后卵母细胞体积开始增大，颗粒细胞继续增殖[8]。始基卵泡激活的调控机制包括以下3个方面[9]，①外部环境：卵泡微环境中含有大量自分泌和旁分泌生长因子，这些因子激活了始基卵泡颗粒细胞（primordial follicle granulosa cells，pfGCs）中的特殊信号通路，进而触发休眠卵泡；②卵泡膜细胞和卵母细胞之间的通讯：由pfGCs分泌的各种激素和生长因子影响卵母细胞的发育，而卵母细胞的质量反过来影响颗粒细胞的质量和数量，从而决定卵泡的激活、发育和凋亡；③物理和机械因素：卵巢组织的机械刺激有助于始基卵泡的激活，如解除细胞接触抑制和改变卵巢组织密度梯度。尽管激活始基卵泡的确切机制尚不清楚，但最近的研究表明，PI3KAKT信号通路和Hippo信号通路在始基卵泡激活中发挥重要的作用[10]。

2.1 PI3K-AKT信号通路 PI3K-AKT信号通路是体内的基础信号通路，可调控细胞代谢、增殖和存活等多种细胞功能。近来，PI3K-AKT信号通路已被证实在卵母细胞内对维持始基卵泡生长和闭锁具有重要的意义[11]。叉头框转录因子O3（FOXO3）是AKT途径下游转录抑制因子，其是卵泡静止的重要调节剂，起到抑制卵泡生长的作用。AKT活化导致FOXO3磷酸化并易位到细胞质从而解除其抑制作用，引起卵泡活化。当AKT失活后，FOXO3去磷酸化回到细胞核内，反式激活靶基因，从而抑制卵泡的活化、成熟[12]。人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）可拮抗PI3K-AKT-FOXO3信号通路，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）向3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）的转化受到抑制，从而阻断AKT活化。PTEN基因沉默时，卵巢内更多的始基卵泡发育为初级卵泡，而始基卵泡的数量减少[13]。特异性敲除小鼠卵母细胞中的FOXO3或PTEN时，都可导致始基卵泡出现过度生长并提前活化，导致幼年小鼠出现卵泡耗竭[14-15]。2010年，体外AKT激活剂（包括PTEN抑制剂和PI3K激活剂）培养被用于激活小鼠休眠卵泡。通过增加AKT活性来激活休眠的始基卵泡，从而导致始基卵母细胞中FOXO3a磷酸化并易位到细胞质。小鼠卵巢移植后，始基卵泡发育至排卵前阶段，将获得的成熟卵母细胞用于IVF-ET后分娩出健康的幼崽[16]。而且在长期随访中证实了其子代的正常性，未发现生殖活动异常和慢性疾病增加[17]。

除此之外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）作为一种高度保守的丝/苏氨酸激酶，也是已知的通过PI3K-AKT途径激活小鼠始基卵泡的介质，抑制mTORC活性是维持始基卵泡休眠的先决条件[18]。mTORC1活性受到结节性硬化复合物1/2（TSC1/2）的负调控，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）抑制剂可抑制小鼠TSC2的活性，从而诱导mTORC以及下游核糖体蛋白S6（RPS6）磷酸化，进而导致始基卵泡的激活[19]。使用mTORC信号通路特异性激活剂联合AKT激活剂处理后的卵巢组织可以进一步提高卵泡激活的成功率并成功获得子代小鼠[20]。

2.2 Hippo信号通路 Hippo信号通路最早发现于果蝇中，后续研究发现Hippo信号通路在哺乳动物和人类体内也广泛存在，且高度保守。哺乳动物中Hippo信号通路的核心激酶级联MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOB1四种肿瘤抑制因子，作用于Hippo途径下游的转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）/转录共激活因子PDZ结合基序（TAZ）[21]。Hippo通路的激活磷酸化了转录共激活因子YAP/TAZ，并导致YAP/TAZ保留在细胞质中与14-3-3蛋白结合或被蛋白酶体降解。当Hippo通路失活时，YAP/TAZ去磷酸化，可自由转运至细胞核与TEAD转录因子结合，从而促进下游靶基因的表达[22]。Hippo信号通路在控制器官生长和再生方面发挥核心作用，受多种生化、物理和结构信号的影响，包括机械信号、细胞极性、细胞-细胞黏附、激素、生物活性化学物质和细胞应激[23]。2013年Kawamura等[24]观察到在卵巢中激活Hippo信号通路可特异性地抑制卵泡激活。研究显示，通过将小鼠卵巢皮质碎裂成小方块，有助于球状肌动蛋白（G-肌动蛋白）聚合为丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）。F-肌动蛋白阻断Hippo信号通路，增加细胞核内YAP蛋白含量，核YAP与共转录因子TEAD1/2/3/4相互作用以刺激下游CCN生长因子和BIRC凋亡抑制剂的表达，促进卵泡活化和生长[25]。2015年该团队还证明了组成型活性YAP转基因的过表达促进了人和小鼠卵巢移植物中的卵泡生长[26]。研究表明，卵巢局部损伤（活检或搔刮）能破坏Hippo信号通路从而促进卵泡生长。Zhang等[27]对80例POI患者行腹腔镜下左侧卵巢活检和右侧卵巢刮伤，术后激素替代治疗6个月并观察卵泡生长情况，结果显示11例患者恢复卵巢功能；在10例患者中回收了3枚处于第二次减数分裂中期（MⅡ期）的卵母细胞，其中1例患者移植2枚新鲜胚胎，最终活产1例健康婴儿。以上方法都是通过机械信号刺激卵巢从而干扰Hippo信号通路，促使卵巢休眠途径失活，使卵泡进入生长发育的轨道（IVA）[28]。Hu等[9]通过检测小鼠卵巢IVA前后始基卵泡中核心成分的定位和表达，发现IVA培养8 d后的小鼠卵巢中MST1和LATS2表达下降，而YAP1表达增加。始基卵泡的激活伴随着Hippo信号通路的减弱，这进一步证实了Hippo通路参与始基卵泡的激活。

2.3 Hippo和PI3K-AKT信号通路交联作用于卵泡激活 Hippo和PI3K-AKT信号通路在其他组织器官和细胞之间存在频繁的交叉“对话”。如TAZ通过抑制PI3K-AKT信号促进骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[29]。Hippo信号通路可直接通过YAP激活啮齿类动物心肌细胞PI3K或通过微小RNA（miRNA）抑制PTEN的表达来诱导PI3K-AKT通路激活[30]。研究发现YAP受到机械刺激和生长因子的信号刺激后，能进入上皮细胞胞核促进细胞增殖并通过PI3K-3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）-AKT途径发出信号[31]。已知PI3K-AKT和Hippo信号通路在始基卵泡激活中发挥着重要的作用，但它们之间互相串扰作用于卵巢始基卵泡活化的具体机制尚未明确。Devos等[32]研究发现对小鼠卵巢片段化处理不仅作用于Hippo通路，对PI3K-AKT通路也有影响。小鼠卵巢片段化处理刺激了PI3K途径，导致AKT和RPS6磷酸化增加，提示在卵巢中Hippo和PI3K-AKT途径之间存在交叉“对话”，两者相互作用诱导体外卵泡激活。而且mTORC1抑制剂可减弱两种途径的激活作用，起到防止卵泡过度激活、保护卵巢储备的作用[33-34]。研究发现AKT抑制剂（MK2206）抑制始基卵泡活化的同时也增强了Hippo通路的活性，但是在转染YAP过表达慢病毒载体的小鼠卵巢中AKT和p-AKT水平无明显变化。此外，YAP1上调部分缓解了AKT下调对始基卵泡活化的抑制作用，表明AKT可能是Hippo通路的上游调控元件[9]。同时提示AKT作为PTEN-PI3K和TSC-mTOR途径的连接点，可将Hippo途径与PI3K-AKT和TSC-mTOR途径联系起来。作用于卵巢卵泡激活的信号通路是极为广泛的，包括Hippo、PI3K-AKT、TSC-mTOR和转化生长因子β（TGF-β）等途径，它们之间相互串扰共同调控着始基卵泡的激活。了解卵巢中信号通路的相互作用，有助于我们从整体水平理解卵泡激活的机制。

3 IVA应用于POI患者的临床进展

利用PI3K-AKT和Hippo途径对卵泡激活和生长的影响，Kawamura等[24]和Suzuki等[35]开发了一种控制始基卵泡激活的方法来治疗POI，并将其命名为IVA，即通过AKT激活剂体外培养卵巢片段，并通过卵巢皮质的碎裂来破坏Hippo信号传导途径，从而激活休眠的始基卵泡，结合常规辅助生殖技术已成功分娩健康婴儿。研究共招募37例POI患者，其中9例患者（24%）有卵泡生长，最终分娩2例健康婴儿[35]。随后，2016年，Zhai等[36]报告14例POI患者摘除一侧卵巢后IVA 2 d，并在其中一侧输卵管浆膜下进行卵巢组织移植。该过程不需要卵巢玻璃化冷冻，这避免了冷冻保存可能导致的卵泡损失，结果显示14例患者中6例（43%）有卵泡发育，并成功分娩1个健康婴儿。虽然IVA已经少量应用于临床并且有成功分娩案例，但仍有不少学者质疑IVA技术在临床实践中的功效与安全性。由于IVA过程涉及IVA药物（AKT激活剂）的使用，IVA药物的致癌性或其他有害作用是临床需要考虑的。最近研究表明，通过PTEN抑制剂激活PI3K-AKT通路导致始基卵泡的活化可能会损害正在生长的卵泡的发育[37]，而卵泡活化也是卵巢组织移植后卵泡丢失的直接重要原因[38]。有学者表示，卵巢组织玻璃化冷冻并结合PI3K激活剂体外培养会严重损害卵泡储备[39]。对于早期POI患者，由于卵巢中残留有次级卵泡，单独的机械刺激（Hippo通路破坏）足以促进卵泡生长[40]。Fabregues等[41]对1例32岁的POI患者行腹腔镜下卵巢部分皮质切除术，未经组织培养（无药物IVA）情况下，将卵巢皮质碎片化后移植到对侧卵巢和卵巢附近的腹腔中。手术后，通过促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）和人绝经期促性腺激素（HMG）诱导3枚成熟卵泡的生长，取卵后常规行IVF-ET，患者成功受孕。随后，该团队对14例POI妇女进行无药物IVA治疗，有7例患者检测到卵泡发育，其中4例患者已成功妊娠[42]。无药物IVA避免了移植组织体外与IVA药物孵育的步骤，是一种介入创伤较少的治疗手段。

4 结语

未来随着人们对调节卵泡生长发育的具体作用机制的深入了解及研究，探索调控始基卵泡激活的多种信号通路及分子之间的相互串扰，可期待找出更多具有高效性及安全性的药物和方法（如体内局部药物的应用或精制/标准化卵巢机械损伤技术）为患者提供保留生育力的新选择。尽管已经有健康婴儿通过IVA技术出生，但仍需要更多的研究旨在优化IVA技术、提升IVA效率并降低其可能带来的潜在危险以确保本IVA程序的安全性。