微小RNA在卵巢颗粒细胞中的研究进展

魏超峰，连方

卵泡的发生需要卵母细胞和周围体细胞间密切的交流。始基卵泡被单层扁平颗粒细胞包裹。当颗粒细胞变成柱状时，形成初级卵泡；然后颗粒细胞增殖，变为复层形成次级卵泡。随后在卵泡内形成充满液体的小空腔，这些空腔合并形成早期窦状卵泡。垂体卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）刺激卵泡进一步生长，空腔继续扩大，形成排卵前卵泡。黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）峰到来后，激活排卵前卵泡，卵丘细胞扩张，同时卵母细胞恢复减数分裂，开始成熟过程。最终形成成熟的卵丘卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complex，COC），准备排卵和随后的受精。卵母细胞的生长需要足够的能量、信息来完成许多重要的细胞事件，包括蛋白质和转录物的积累以及表观遗传学的修饰。卵丘颗粒细胞通过特殊的缝隙连接吸收葡萄糖并将代谢产物及信息转运传递到卵母细胞[1]。可见在卵母细胞发生直至成熟、排卵的过程中，颗粒细胞发挥了重要的作用。颗粒细胞的功能受到多个水平调控，其中微小RNA（microRNAs，miRNAs）作为转录后水平的调控分子，近年在颗粒细胞中的作用受到广泛关注。MiRNAs是一些5′端带磷酸基团、3′端带羟基，长度约为19～25个核苷酸的非编码调控RNA。其通过与靶mRNA的3′端非翻译区（untranslated region，UTR）结合，介导翻译调控miRNAs与靶mRNA的3′-UTR区是一种非完全互补结合，阻止靶mRNA的翻译，影响蛋白质表达水平，从而抑制基因表达。综述miRNAs在颗粒细胞中的研究进展。

1 MiRNAs与颗粒细胞增殖、分化

颗粒细胞是支持卵泡生长和卵母细胞发育的关键部分，颗粒细胞的增殖和终末分化对卵泡成熟及排卵至关重要。既往研究发现小鼠中负责增殖和分化的基因周期蛋白D2（cyclinD2，CCND2）和分子质量为27 ku的热稳定蛋白（p27 kinase inhibit protein1，P27）的缺失，导致颗粒细胞增殖减少和黄体生成受损，从而导致不成熟卵泡生成和排卵失败。Andreas等[2]通过对牛卵巢颗粒细胞研究，发现miR-17-92簇通过靶向人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphataseand tensin homologuedeleted on chromosometen，PTEN）和骨形成蛋白受体2基因（bone morphogenetic protein receptorⅡ，BMPR2）调控颗粒细胞增殖和分化，miR-17-92簇的过度表达促进了颗粒细胞的增殖，降低了分化细胞的比例，抑制miR-17-92簇的表达导致颗粒细胞增殖减少和分化增强。有研究发现miR-93通过靶向细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor1A，CDKN1A）促进多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者卵巢颗粒细胞增殖以及从G1期向S期转化[3]。另有研究发现在PCOS患者中miR-335-5p通过靶向抑制血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3（serum-and glucocorticoid regulated protein kinase 3，SGK3）的表达，抑制颗粒细胞的增殖[4]。陈龙等[5]发现miR-184在PCOS组织中呈高表达，且miR-184能够促进卵巢颗粒细胞的增殖，其作用机制与丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的激活有关。这些结果提示miRNA可能是改善PCOS颗粒细胞功能紊乱的新的分子靶点。对早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI） 患者的研究发现，miR-379-5p在颗粒细胞中差异表达，随后的功能研究证实miR-379-5p的过度表达通过靶向聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶基因（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）和X-射线损伤修复基因6（X-ray complementing defective repair inchinese hamster cells 6，XRCC6）抑制了颗粒细胞的增殖，这可能是miRNAs参与POI发病机制的一种途径[6]。Ai等[7]发现miR-181b、miR-15a和 miR-30d 在 卵 巢 早 衰（premature ovarian failure，POF）患者中的表达显著升高，进一步研究证实miR-15a靶向大肿瘤抑制因子1（large tumor suppressor gene 1，Lats1）3′UTR不仅抑制了颗粒细胞的增殖和生长，而且诱导了颗粒细胞的衰老。Zhang等[8]对卵巢反应不良（poor ovarian response，POR）的年轻患者研究发现，miR-15a-5p表达显著升高，其通过调节磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳动物的雷帕霉素靶（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin，PI3K-AKT-mTOR）信号途径抑制颗粒细胞增殖。可见miRNAs在POF、POR发病过程中扮演了相关角色。

颗粒细胞的增殖-凋亡平衡对于卵巢内的激素微环境、卵子及之后胚胎的形成和生长发育都具有极其重要的影响。蒋秀敏等[9]通过人为调控对miR-483-5p进行超表达，发现超表达后颗粒细胞的增殖受抑制，凋亡率增加，并证实miR-483-5p通过靶向细胞外信号调节激酶1（extracelluar signal regulated kinase 1，ERK1）参与调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡。研究发现miR-383可通过抑制细胞周期相关蛋白的表达，将颗粒细胞周期阻滞在G0/G1期，进而抑制卵泡颗粒细胞的增殖[10]。Yerushalmi等[11]对从未成熟卵体外成熟培养技术（in vitro maturation，IVM）获得的生发泡COC中获得的卵丘颗粒细胞和从体外受精 技 术 （in vitro fertilization，IVF） 获 得 的 M Ⅱ（metaphaseⅡ）COC中获得的卵丘颗粒细胞的转录组和微单体进行了综合分析，鉴定出43个差异表达的miRNAs，且在MⅡCOC细胞中所表达的miRNAs均上调，这表明miRNAs在排卵后期的主要作用是控制和抑制颗粒细胞的增殖。

2 MiRNAs与颗粒细胞凋亡

女性出生时卵巢中约有200万个原始卵泡，最终仅有约400个卵泡可成功排出，99%的卵泡因为闭锁而均未得到利用，因此提高卵泡的利用率尤为重要。而卵泡闭锁的基本机制是颗粒细胞凋亡，研究发现过早去除未成熟卵母细胞中的卵丘颗粒细胞，会导致成熟促进因子水平持续降低，存活因子、营养素和细胞周期蛋白的耗竭，减数分裂能力的降低、促凋亡因子以及凋亡因子的增加，最终导致卵母细胞凋亡[12]。已有研究发现颗粒细胞凋亡受到miRNAs的影响。研究发现miR-1275通过直接与肝受体同源物1（LRH-1）的3′UTR结合来减弱LRH-1的表达，阻止了LRH-1蛋白与细胞色素P450家族19亚家族A多肽1（cytochrome P450 family 19 subfamily Amember 1，CYP19A1）启动子的相互作用，抑制了雌二醇（E2）的合成，促进了颗粒细胞的凋亡[13]。Sun等[14]研究发现miR-204通过靶向肿瘤蛋白翻译控制1（tumor protein translationally-controlled 1，TPT1，一种肿瘤生长相关蛋白）抑制卵巢颗粒细胞增殖、促进凋亡。miR-204在PCOS患者的颗粒细胞和卵巢皮质组织中表达下降，使得TPT1过度表达，抑制了miR-204诱导的颗粒细胞凋亡和细胞周期改变。miR-204提高G2/M期细胞比例，降低S期细胞比例，诱导细胞凋亡。研究发现与PCOS患者和正常患者的颗粒细胞水平相比，POR患者的颗粒细胞中miR-23a水平升高，miR-23a的过度表达降低了抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）的水平，升高了凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）的水平，进一步研究发现，与抑制剂组和阴性对照组相比，miR-23a模拟物转染细胞的ERK1/2磷酸化明显降低[15]。这些结果提示miR-23a通过激活ERK1/2信号通路诱导人卵巢颗粒细胞凋亡。此外，在对卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）患者的研究中发现，有15种miRNAs在DOR患者的颗粒细胞及血清中差异表达，其中miR-106a显著下调，证实其可能通过凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1） 信号通路，降低颗粒细胞活力，促进颗粒细胞凋亡，从而参与DOR的发病机制[16]。对鼠POF模型的研究发现，骨髓间充质干细胞来源的外显子携带的miR-644-5p，通过靶向p53基因抑制卵巢颗粒细胞凋亡，提示miR-644-5p具有治疗POF和恢复卵巢功能的作用[17]。MiR-21和miR-132/212在人绒毛膜促性腺激素诱导的排卵过程中表达增加，影响颗粒细胞的凋亡，调节排卵过程[18]。Zhang等[19]研究发现miR-21参与了去甲肾上腺素介导的颗粒细胞凋亡，且通过靶向与果蝇Mad蛋白及线虫Sma蛋白具有同源性的蛋白质家族7（Smad7）阻断颗粒细胞凋亡。有证据表明miR-Let7g可通过线粒体途径促进颗粒细胞凋亡，进而引起卵泡闭锁[20]。Du等[21]发现miR-143通过靶向下调FSH受体的表达，降低细胞内蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）等信号分子水平，诱导猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。miR-34a可通过调控Bcl-2、Bcl相关X蛋白 （Bclassociated X protein，Bax）等凋亡相关的蛋白与基因的表达，促进人颗粒细胞凋亡[22]。可见miRNAs在颗粒细胞凋亡的调控过程中占据重要地位，对于与颗粒细胞凋亡异常密切相关的疾病，如PCOS、DOR和POF等，特定的miRNAs水平可在一定程度上反映疾病的状态，miRNAs类似物或抑制剂有望成为新的治疗手段。

3 MiRNAs与颗粒细胞性激素分泌

女性生殖内分泌功能受下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的调节，是一个具有层次性、具有反馈与负反馈的机制。下丘脑脉冲式分泌促性腺激素释放激素（GnRH），刺激垂体分泌FSH与LH。其中FSH刺激次级卵泡的募集和颗粒细胞分泌E2，从而促进卵泡成熟，LH触发排卵，促进黄体发育，刺激卵泡膜细胞产生雄激素。卵母细胞被内层颗粒细胞和外层卵泡膜细胞所包围。这2种类型的细胞在其整个生命周期中都具有类固醇活性。其中颗粒细胞在月经周期中对FSH和LH均有反应，卵泡膜细胞只对LH有反应。研究显示miR-7a2通过调节垂体前列腺素和骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）信号通路，连接miR-7基因回路来调节FSH和LH的合成和分泌，从而对性成熟和生殖功能起关键的调节作用[23]。

生成类固醇激素是颗粒细胞在卵泡发育过程中的重要作用。CYP19A1基因编码芳香化酶，而芳香化酶是合成E2的关键酶，研究发现CYP19A1可刺激猪卵巢颗粒细胞分泌E2，而miR-10b可直接与猪CYP19A1基因的3′-UTR相互作用，抑制其在猪颗粒细胞中的表达和功能[24]。另有研究发现在PCOS患者中，miR-27a-3p靶向环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1（cyclic-AMP response element binding protein 1，Creb1），负性调节其下游因子CYP19A1基因的表达，导致颗粒细胞中雌激素的产生减少、雄激素在颗粒细胞中积累[25]。miR-27a-3p可导致雌激素/雄激素失衡，表明其可能参与了PCOS的发生机制。PCOS患者的重要特征是无排卵，体内高水平的E2可阻止FSH水平的升高，而FSH是卵泡生长和诱导排卵的重要因素，低水平的FSH会导致无排卵。Huang等[26]通过对比PCOS患者和正常人卵丘细胞miRNAs表达谱发现17个miRNAs在PCOS患者卵丘细胞中的表达有显著差异，进一步研究发现miR-509-3p通过抑制丝裂原活化蛋白3激酶8（mitogen-activated protein3 kinase8，MAP3K8）的表达，提高了E2的分泌，这可能是miRNAs参与PCOS患者无排卵的一种发病机制。据报道miR-24和miR-19可减少培养的人卵巢细胞的睾酮释放[27]。此外，miR-24、miR-150和miR-151转染人卵巢细胞后，E2释放降低，进一步说明这些miRNAs可能对颗粒细胞分泌性激素有重要作用。研究表明miR-143、miR-132能够促进FSH介导的颗粒细胞孕酮的分泌[28-29]。另有研究发现miR-143负调控FSH介导的信号通路，通过靶向V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒同源癌基因（v-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogenehomolog，KRAS）影响E2的产生[30]。许多miRNAs能降低孕酮、睾酮和E2，但目前只有miR-107能增加睾酮的释放，这种特异性miRNAs在PCOS患者的颗粒细胞中也显著上调。可见miRNAs对颗粒细胞分泌性激素有重要影响，由此推测miRNAs水平在一定程度上可反映卵泡的成熟度及质量。

综上，miRNAs参与调控了颗粒细胞增殖、分化、凋亡、性激素合成等过程，虽然越来越多的miRNAs及其靶基因被发现，但具体机制以及潜在的宏观调控网络目前尚未完全阐释清楚，且哪些miRNAs是敏感的、对临床有实际意义的，仍需进一步研究。随着研究技术的不断发展，miRNAs有望成为卵巢相关疾病的辅助诊断标志物，miRNAs的类似物及抑制物有望成为新的治疗方案。