橙皮素对17 ℃负压环境下猪精子保存质量的影响

李雁冰，王硕，李井春，孙天宇，魏国生

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

家畜的人工授精技术起源于20 世纪初期，并于20 世纪30 年代掀起了研究热潮，时至今日人工授精技术已成为养殖业的重要技术支撑之一。在2011 年1 月1 日颁布的文件《猪常温精液生产与保存技术规范》国标中指出猪常温精液为“经稀释后在16～18 ℃下短期保存，仍具有受精能率的精液”[1]。人工授精技术作为重要的繁育方法，其中精液保存是人工授精技术重要的环节至关重要，与其他牲畜相比猪精子对温度变化比较敏感，且常温保存（17～25 ℃）不需要特殊设备，操作简单方便，便于短期保存等优点，因此是生产中猪精液保存的常用方法。在精子常温保存过程中，猪精液稀释液主要是为精子活动提供所需的能量，抑制微生物生长繁殖，创造相对稳定的生存环境，从而达到保证猪精液品质的目的。目前，猪稀释液的pH 值、渗透压、抗氧化能力等是猪精液保存过程中重要的影响因素，这些影响因数直接或间接的影响母猪的受胎率，研究表明人工授精中一次输入损失的精子数量达到45%左右，那么通过提高精液质量可提高受胎率[2-3]。

在常温保存过程中，由于精子自身代谢等原因产生的大量活性氧（ROS）致使细胞膜损伤，而在猪稀释液中添加一定量的外源性抗氧化剂是目前最直接的方法，同时降低精子代谢速度也是有效措施。橙皮素（Hesperetin：Vitamin P）属于生物类黄酮，植物提取物，具有消除氧自由基、抗氧化、抗癌等功能。在近些年相关研究中，刘亚伟[4]发现低温保存中向猪精液稀释液中添加橙皮素显著地提高了精液的品质，除此之外，橙皮素在猪精液常温保存相关领域鲜有报道。在精液常温保存时，在猪精液中加入稀释液可以为精子提供一定能量，同时减少猪精子能量消耗，使精子存活的时间更长，提高精子的受精能力[5]。目前商品猪精液常温保存多为3～5 d，为了更好地延长精子存活时间，提高精子的受精能力，试验通过在Modena稀释液中添加不同剂量的橙皮素，同时采用17 ℃和负压环境条件，从温度与低氧两个方面降低精子代谢速度。试验利用迈朗全自动精子质量检测仪检测精子活率、活力、直线速度、侧摆幅度、鞭打频率、畸形率等质量参数，探究橙皮素在17 ℃负压环境下对猪精液保存效果，为稀释液配方的完善提供一定的基础依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

橙皮素购于上海源液生物技术有限公司；Modena 稀释液组成为每1 L 溶液中含：青霉素0.074 g；链霉素0.05 g；葡萄糖27.50 g；NaHCO31 g；柠檬酸2.9 g；柠檬酸钠6.9 g；TRIS 5.65 g；EDTA-2Na 2.6 g；BSA 4 g。Modena 稀释液药品成分均购自西格玛公司。

1.1 精液来源

精液采自黑龙江八一农垦大学猪场，采集3 头健康长白种公猪混合精液，年龄为2～3 岁。无异味、色泽为乳白色、精子活力在0.7 以上的精液。

1.3 实验方法

1.3.1 猪精液的稀释

精液运送到实验室后，将精液从保温箱中取出放入无菌操作台，用3 层纱布包裹后在室温下平衡降温30 min。平衡降温后取10 μL 原精液滴入载玻片上，并放于37 ℃加热板上孵育2～3 min，通过迈朗全自动精子分析仪检测12 个视野区的猪精子质量参数，精子活力不低于0.7[6]，精子质量符合实验标准后进行对原精液的稀释处理。猪精液稀释处理方法为将原精液分装入15 mL 离心管中进行离心，离心转数为1 800 r·min-1，离心时间为5 min。离心后去除上清液，采用精板计数法检测离心后的浓缩精液的精子密度，用各组试剂稀释液将浓缩精液稀释计算调整密度为1×108个·mL-1，精液离心后对精液稀释过程要在15 min 内完成，避免由于精子沉积而造成机械损伤，稀释后各稀释组在室温下保存待用。

1.3.2 精液保存处理

将稀释后的各组试管口用铝纸包裹封口，将各组试管缓慢置于负压保存瓶中，用带有空气流通开关的活塞密封负压保存瓶，将负压保存瓶连接真空泵机，通过真空泵机将负压保存瓶调整负压为0.4 倍大气压强。负压处理后将负压保存瓶置于17 ℃恒温箱中保存。每隔12 h 对各组试管中的精液进行缓慢混匀，避免精子沉聚而损伤。

1.3.3 精子质量参数的检测

根据试验设计，在保存的各时间段（0 h，1，2，3，4，5 d）定时取样，样品需在37 ℃加热板上复苏2～3 min，通过迈朗全自动精子分析仪检测精子活率、活力、直线速度、侧摆幅度、鞭打频率、畸形率等质量参数，并记录实验数据。

1.4 试验设计

试验共设计5 组，在Modena 基础稀释液中添加橙皮素，调节浓度分别为0 L、40、80、120、160 μg·mL-1的橙皮素，试验设3 次重复试验。通过迈朗全自动精子分析仪检查不同的保存时间下精子活率、活力、直线速度、侧摆幅度、鞭打频率、畸形率等质量参数。1

.5 统计分析

将各时间段的各试验组质量参数数据利用Excel 进行汇总，再利用StatView 5.0 软件对实验测定的各项参数进行方差分析和多重比较，实验结果用平均数±标准差来表示。同行数据肩标字母不同，表示差异显著P<0.05。

2 结果与分析

2.1 橙皮素对精子活率的影响

由表1 可知，添加橙皮素后0 μg·mL-1L 组在17 ℃负压环境下保存1～2 d 时的精子活率显著高于160 μg·mL-1组（P＜0.05），而40、80、120 μg·mL-1组之间差异不明显；在保存3 d 时，0、40 μg·mL-1组精子活率显著高于80、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）；在4～5 d内40 μg·mL-1组的精子活率显著高于其组，且80、120 μg·mL-1组精子活率显著高于0、160 μg·mL-1组（P＜0.05）。

表1 橙皮素对精子活率的影响（单位：%）Table 1 The effect of hesperetin on sperm motility rate（unit:%）

2.2 橙皮素对精子活力的影响

由表2 可知，添加橙皮素后0、40 μg·mL-1组在17 ℃环境下保存1～2 d 时的精子活力显著高于80、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）；在17 ℃环境下保存3 d 时，40、80 μg·mL-1组精子活力显著高于0、120、160 μg·mL-1组且120、160 μg·mL-1组精子活力显著高于0 μg·mL-1组（P＜0.05）；在17 ℃环境下保存4～5 d的时间内40、80 μg·mL-1组的精子活力显著高于0、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）。

表2 橙皮素对精子活力的影响（单位：%）Table 2 The effect of hesperetin on sperm motility（unit:%）

2.3 橙皮素对精子直线速度的影响

由表3 可知，添加橙皮素后在17 ℃负压环境下保存2 d 时，40 μg·mL-1组精子的直线速度显著高于其他组（P＜0.05）；在保存3～4 d 内40、80 μg·mL-1组的直线速度显著高于其他组（P＜0.05）；在保存5 d时、40、80 μg·mL-1组的精子直线速度显著高于120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）。

表3 橙皮素对精子直线速度的影响（单位：μm·s-1）Table 3 The effect of hesperetin on sperm linear velocity（unit:%）

2.4 橙皮素对精子侧摆幅度的影响

由表4 可知，添加橙皮素后在17 ℃负压环境下保存1～2 d 内的精子侧摆幅度各组间无显著差异（P＜0.05）；在保存3 d 时，各试验组精子侧摆幅度显著高于0 μg·mL-1组（P＜0.05）；在保存4～5 d 内40、80 μg·mL-1组 的 直 线 速 度 显 著 高 于0、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）。

表4 橙皮素对精子侧摆幅度的影响（单位：μm）Table 4 The effect of hesperetin on sperm Side swing amplitude（unit: μm）

2.5 橙皮素对精子鞭打频率的影响

由表5 可知，添加橙皮素后、160 μg·mL-1组（P＜0.05）在17 ℃环境下保存1 d 时的精子鞭打频率显著高于120 μg·mL-1组（P＜0.05），其中0、80、160 μg·mL-1组（P＜0.05）之间的精子鞭打频率无显著差异，40、80、120 μg·mL-1组（P＜0.05）之间的精子鞭打频率无显著差异；在17 ℃环境下保存2 d 时5 个试验组别的精子鞭打频率无显著差异；在17 ℃环境下保存3 d 时0 μg·mL-1组的精子鞭打频率显著高于40、80、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）；其中80 μg·mL-1组的精子鞭打频率显著高于40 μg·mL-1组（P＜0.05），且80、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）之间无显著差异，40、120、160 μg·mL-1组（P＜0.05）之间无显著差异；在17℃环境下保存4～5 d 时5 个试验组别的精子鞭打频率无显著差异。

表5 橙皮素对精子鞭打频率的影响（单位：Hz）Table 5 The effect of hesperetin on sperm beat cross frequency（unit: Hz）

2.6 橙皮素对精子畸形率的影响

由表6 可知，添加橙皮素后40 μg·mL-1组在17 ℃负压环境下保存1 d 时的精子畸形率显著低于其他组（P＜0.05），在保存2～4 d 时0、120、160 μg·mL-1的精子畸形率显著高于40、80 μg·mL-1组（P＜0.05）；在保存5 d 时0、160 μg·mL-1组（P＜0.05）的精子畸形率显著高于80、120、40 μg·mL-1组（P＜0.05），且120、80 μg·mL-1组之间无显著差异（P＜0.05）。

表6 橙皮素对精子畸形率的影响（单位：%）Table 6 The effect of hesperetin on abnormal sperm rate（unit:%）

3 讨论

试验中，选用的Modena 稀释液对精子保存效果良好[7-8]。在猪精液中添加稀释液能够为猪精子提供类似于睾丸内的理想存活环境，提高猪精子细胞膜的完整性，去除不利于猪精子长期保存的影响因素，为猪精子提供丰富的营养物质，同时在提高猪精液质量和猪精子受精力的前提下降低猪精子代谢强度，使猪精子达到可逆转的休眠状态。在猪的稀释粉中所含的多种成分对精液长期保存影响较大[9]，试验在Modena 稀释液中的葡萄糖等可以为猪精子代谢提供能量，缓冲物质可维持猪精液pH 的稳定，碳酸氢钠、柠檬酸钠可以中和细菌的代谢产物，从而维持相对稳定的pH 环境[6]。而试验中在稀释液中添加橙皮素，目的在于提高精液的抗氧化能力，减弱由于猪精子和细菌代谢所产生的ROS 对猪精子的损伤，完善稀释液的功能，为猪精子提供更易存活的理想环境。

在精子质量检测中精子活率是反映精液质量的常规指标[10]。精子的活率指标和精子的运动性能参数与精子细胞结构和精子功能存在高度的相关性，通过检测这些质量参数可以预测精子的潜在授精能力[11]。精子的运动性与授精能力存在相关性，是最重要的检测手段之一，精子的运动性包括精子活率和运动速度[12-13]。所以试验通过迈朗全自动精子分析仪检测精子活率和运动速度，从试验结果可知，随着保存时间的增加，在4～5 d 期间40 μg·mL-1组的精子活率显著高于其他组。这与刘亚伟[4]的研究结果趋于一致，橙皮素具有清除自由基和抗氧化的能力，其作用机理主要是阻止自由基在细胞内形成的3 个阶段，即与O2-反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止OH-生成；与脂质过氧基ROO-反应阻止脂质过氧化过程，橙皮素对常温保存的猪精液品质有一定程度的提高。在试验中，在2 d 时各组都发现一定量的细菌滋生，这也可能是0 μg·mL-1组在3～4 d 时精子活率相较其他4 个试验组下降趋势明显的主要原因。茆达干等[14]研究表明，精液中滋生一定量细菌后对精液保存效果影响较大，造成精子活力、顶体完整率、精液pH 值等质量参数大幅度下降。试验说明一定浓度的橙皮素能提高精子活率，并有一定的抑菌作用，橙皮素浓度为40 μg·mL-1为最佳。

实践证明，所输精液量和精子活力对配种效率、产仔数、仔猪断奶成活率、断奶体重和生产性能都有很大影响，活力对于精子受精能力是很重要的，是保证精子在受精过程中与卵子相遇的重要条件[15-16]。从试验结果可以看出随着保存时间的增加，稀释液中的精子活力呈明显下降趋势。在17 ℃环境下保存的2 d 内，0 μg·mL-1组、40 μg·mL-1组的精子活力已显著高于其他试验组，但在第3 d 起40 μg·mL-1组的精子活力显著优于其他4 个试验组，且对照组保存效果最不理想，究其原因可能是4 个试验组在试验2 d开始有存在不同程度的细菌滋生。精子直线速度参数是反映精子活力的重要指标之一，无论是直线运动的精子，还是环绕运动的猪精子或者是原地运动的猪精子，它们都有活动的能力，可以说都有活力[17]。而直线运动的精子才属于有效精子，因而精子的直线速度相较于其他速度指标更具有代表性。试验中从2 d 开始，40 μg·mL-1组精子的直线速度显著高于其他组，而1 d 时各组差异不明显，研究表明黄酮类化合物被吸收后往往通过血清白蛋白进行贮存和运送，进而发挥作用[18]。而橙皮素与血清蛋白形成络合物的时间与Cu2+等金属离子有关，而精液稀释液配制采用的均为去离子水，可能因此影响了药效发挥时间。从而说明一定浓度的橙皮素能提高精子直线速度和间接提高精子活力，对精子保存有促进作用，橙皮素浓度为40 μg·mL-1为最佳。

哺乳动物精子在进出雌性生殖道获能前运动方式变化很大，在此期间精子经历了复杂的生理变化，运动方式发生了很大的改变，运动状态更为强烈，表现出“鞭打”“小环形抛物”等运动形式，这样的过程被称为超激活[19]，超激活主要表现形式是鞭毛鞭打的程度不对称性和相对较高的鞭打振幅[20]。超激活现象与精子的运动方式有关，有学者将侧摆幅度（ALH）≥7 μm 作为其参数指标，用以鉴定超激活运动。精子的鞭打频率即精子的头部运动偏离精子运动平均路径的频率，由试验结果可以看出，随着时间的推移，所有试验组别的精子鞭打频率呈现递减趋势，但是并未筛选出最适宜浓度组，但试验组与对照组的精子鞭打频率并无显著差异，说明添加适量浓度橙皮素试验组对于精子鞭打频率并无抑制作用，对此其相关作用机制有待进一步研究。同时畸形率对精子运动性也存在一定的影响，研究表明化学物质，环境温度，细菌病毒感染，遗传因素等均可引起精子畸形。从试验结果可知，添加橙皮素后在3～4 d 内40 μg·mL-1组、80 μg·mL-1组的侧摆幅度显著高于其他组，且40 μg·mL-1组从1 d 开始畸形率要明显低于其他组，说明橙皮素抗病毒抑菌作用在极低浓度就可抑制致病革兰氏阴性菌，从而降低了畸形率和提高侧摆幅度。同时试验采用负压处理，模拟公猪睾丸负压低氧环境，可有效降低精液含氧量，减缓精子代谢过程，再结合橙皮素的抗氧化和抗病毒抑菌作用，从而提高精液配方的抗氧化性和抑菌作用，延长精液的保存时间。

4 结论

试验得出在精液基础液中添加一定量的橙皮素在17 ℃负压环境下可显著提高猪精子的活率、直线速度、侧摆幅度，降低精子畸形率。其中40 μg·mL-1组各项参数显著优于其他组，添加40 μg·mL-1的橙皮素最有利于猪精子在17 ℃环境下的保存，研究结果为猪人工授精生产实践中精液保存技术的发展提供依据。