过滤方式及不同稀释液对驴精子低温保存活率的影响

杨旭，杨亚亚，曹燕，丁向彬，郭益文，郭宏，刘新峰

（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384）

驴为马属动物，具有性情温和、环境适应能力强、便于饲养等特点[1]。近年来随着人们生活水平的逐渐提高，驴作为“使役工具”的时代已经过去，而驴本身及其副产品逐渐演变成人们生活中的“营养食品”或“药用食品”，如驴乳、驴肉、驴皮、驴鞭、驴血、驴骨等都具有很高的营养和药用价值。目前已知，驴肉中蛋白质、不饱和脂肪酸以及微量元素的含量均高于猪、牛和羊肉，而脂肪含量低于猪、牛和羊肉[2-3]。据报道，全世界养驴数在 1996年时已达到4 346.7万头，其中养驴数目最多的是亚洲，达2 131.6万头，中国的养驴数占到亚洲的51.24%，达1 092.3万头。但到1997年统计时发现，全世界养驴数减少到 4 331.8万头，我国减少到1 073.3万头[4]。截至2016年，我国养驴数仅为456.9万头，占世界驴存栏量4 412.56万头的10.35%[5]。驴养殖数量的持续下降，主要与国内外养殖业以猪、牛、羊养殖为主，驴品种资源少、繁殖效率低有关。精液保存的目的是能最大限度地延长精子的存活时间且维持其受精能力。保存的精液经不同地区间的运输，可扩大精液的使用范围、增加受配动物的数量、提高种公畜的利用效率，使优良种公畜的繁殖潜力和遗传优势得到充分发挥。目前，驴精液保存的相关研究还比较少，随着养驴业的兴起和不断发展，开展驴精液保存的研究，不仅可以解决我国驴存栏量持续减少和养驴规模日益缩小的问题，也可进一步推动养驴生产的发展。本文主要针对驴精液的低温保存展开研究，以期筛选出适合驴精液的低温保存稀释液及稀释液的过滤方式，旨在为提高驴的繁殖效率奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择4～6岁健康的种公驴5头，且具有正常生殖能力，种公驴均由天津龙天畜牧养殖有限公司提供并养殖，每日定时饲喂，自由采食，自由饮水。

1.2 试验试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris），北京鼎国昌盛生物技术有限公司生产；柠檬酸，天津大学科威公司生产；葡萄糖，天津市北方天医化学试剂厂生产；果糖、青霉素和链霉素均由 Amresco生产；氧化石墨烯，AFNANO.INT生产；VC，Alfa Aesar（china）生产；VE，东京化成工业株式会社生产。

1.3 方法

1.3.1 稀释液的配置

（1）基础液的配置：Tris，3.04 g；柠檬酸，1.70 g；葡萄糖，1.5 g；果糖，1.5 g；青霉素，0.08 g；链霉素，0.14 g；双蒸水100 mL。（2）稀释液的配置：取适量基础液，按体积百分比添加 15%卵黄作为低温保存基础液；取适量低温保存基础液分别添加不同浓度的VC、VE和氧化石墨烯（见试验分组），开展后续试验。

1.3.2 试验分组

（1）稀释液过滤方式：第一组为基础液添加15%卵黄后过滤；第二组为基础液过滤后再添加15%卵黄；第三组为卵黄过滤后，再按 15%的体积百分比添加到基础液中（各组的过滤方式均为先用0.45 μm孔径的过滤器过滤，再用0.22 μm孔径的过滤器过滤）。（2）VC添加组：取适量低温保存的基础液过滤后再添加 15%卵黄的稀释液，分别按100、200、300 μg/100 mL浓度添加VC。（3）VE添加组：取适量低温保存的基础液过滤后再添加15%卵黄的稀释液，分别按5%、10%、15%浓度添加VE。（4）氧化石墨烯添加组：取适量低温保存的基础液过滤后再添加 15%卵黄的稀释液，分别按 20%、25%、30%浓度添加氧化石墨烯。

1.3.3 鲜精的采集及低温保存

使用假阴道法采集精液，4层无菌纱布过滤，收集到50 mL灭菌离心管内。将采集的鲜精和各组稀释液分别按体积比为1∶2的方式添加到5 mL灭菌离心管中，混合均匀后将离心管封口放入盛有25 ℃水的烧杯中，转移至4 ℃冰箱中保存，每隔24 h或48 h观察精子的活率，并进行记录。

1.3.4 统计与分析

试验所得的数据用SPSS 20.0进行处理，用方差分析做差异显著性检验，数据结果均用“平均数±标准差”进行表示。

2 结果与分析

2.1 稀释液不同过滤方式对驴精子低温保存活率的影响

由表1可见，在低温保存2、4、6 d后，3组间精子活率均无显著性差异（P＞0.05）；在低温保存1 d后3组间精子活率均有显著性差异（P＜0.05），且第二组稀释液中精子活率最高；在低温保存3 d后，第二组和第三组间精子活率存在显著差异（P＜0.05），但第一组与其他两组间差异不显著（P＞0.05）；在低温保存5 d后，第二组与第一组和第三组间精子活率均有极显著差异（P＜0.01），而第一组和第三组间无显著差异（P＞0.05）。综合以上结果，分析可知第二组精子低温保存效果优于第一组和第三组。

表1 稀释液不同过滤方式对驴精子低温保存活率的影响

2.2 不同浓度VC对驴精子低温保存活率的影响

由表2可见，添加3种不同浓度VC的稀释液，在低温保存4、6 d后3组间精子的活率均无显著差异（P＞0.05）；在低温保存 2 d时发现，添加100 μg/100 mL VC的稀释液精子活率最高，与添加200和300 μg/100 mL VC的稀释液组间的精子活率存在显著性差异（P＜0.05），但添加 200和300 μg/100 mL VC的稀释液组间的精子活率无显著差异（P＞0.05）；进一步分析结果发现，低温保存8 d后与低温保存2 d后的试验结果截然相反，添加200和300 μg/ 100 mL VC的稀释液组间无显著差异（P＞0.05），但与添加100 μg/100 mL VC的稀释液组的精子活率均存在显著差异（P＜0.05）。结合以上结果分析认为，添加200和300 μg/ 100 mL VC的稀释液比较适合驴精子的低温保存。

表2 不同浓度VC对驴精子低温保存活率的影响

2.3 不同浓度VE对驴精子低温保存活率的影响

由表3可见，在低温保存2 d后，添加5% VE稀释液中的精子活率极显著高于添加浓度为 10%VE的稀释液（P＜0.01），显著高于添加浓度为15%VE的稀释液（P＜0.05）；在低温保存4和6 d后，3组精子间的活率均无显著性差异（P＞0.05）；在低温保存8 d后，添加15% VE的稀释液保存的精子活率最低，且与其他两组相比有显著性差异（P＜0.05）；在低温保存10 d后，添加5% VE的稀释液中精子活率最高，与添加浓度为 10% 和15% VE的稀释液组间的精子活率存在极显著差异（P＜0.01）；综上分析可知，当稀释液中VE的浓度为5%时最适合驴精子的低温保存。

表3 不同浓度VE对驴精子低温保存活率的影响

2.4 不同浓度氧化石墨烯对驴精子低温保存活率的影响

由表4可见，在低温保存2 d后，添加30%氧化石墨烯稀释液与添加 25%氧化石墨烯稀释液中的精子活率存在极显著性差异（P＜0.01），添加30%氧化石墨烯稀释液与添加 20%氧化石墨烯稀释液中的精子活率存在显著性差异（P＜0.05），添加20%氧化石墨烯稀释液与添加 25%氧化石墨烯稀释液中的精子活率无显著性差异（P＞0.05）；在低温保存4和6 d后，3组稀释液保存的精子活率均无显著性差异（P＞0.05）；在低温保存8 d后，3组不同浓度稀释液中的精子活率均有显著性差异（P＜0.05），添加 30%氧化石墨烯稀释液中的精子活率高于其他2组。综上分析可知，当稀释液中氧化石墨烯的浓度为 30%时，较适合驴精子的低温保存。

表4 不同浓度氧化石墨烯对驴精子低温保存活率的影响

3 讨论

稀释液的无菌程度可影响精子的保存时间。通常情况下，在进行精子保存时，只对配制基础液的水作无菌处理，而对配制好的基础液及基础液中添加的卵黄都不做进一步的无菌处理，基于此，本研究针对基础液及添加的卵黄进行不同方式的过滤处理，尽量达到无菌的要求，进一步筛选出可以延长精子保存时间的过滤方式。通过试验发现，单独过滤基础液后再添加卵黄对驴精子保存的效果优于单独过滤卵黄后再添加到基础液中的保存效果，同时也优于卵黄添加后再进行过滤的保存效果。本研究结果表明，单独过滤基础液可以提升基础液的无菌程度，使驴精子的保存效果更好，但过滤卵黄后驴精子保存效果较差。分析原因，可能是因为卵黄过滤后破坏或减少了卵黄中有利于精子保存的物质。已有报道表明，卵黄中对精子起保护作用的主要是卵磷脂，含卵黄的精液保存液可以获得比较理想的保存效果[6]。Rota等研究发现，添加2%的卵黄对驴精子进行冻存，解冻后精子的活力会增强[7]。这些报道证实了卵黄对精子保存的重要性。

VC作为常见的抗氧化剂，已有将VC应用在精液保存中的报道。赵宪林等研究发现 VC可提高精子低温保存后的活率及顶体完整率，并且可以降低低温保存对精子的危害[8]。姚桂东等研究也发现，VC有缓解热应激的功效[9]，在低温保存时会有缓慢降温的操作，稀释液中添加 VC可以减弱温度突然降低时对精子的损伤。本次试验也证实添加 VC后，驴精子的存活时间明显延长，在第八天时精子活率在0.40以上。

VE是动物机体内重要的抗氧化剂，对细胞膜、线粒体或网状组织的磷脂有着特殊的亲和性，可以亲和在膜的特定部位，预防或阻止诱发脂质过氧化反应，使之无法生成过氧化脂质的老化因子，从而起到保护精子膜免受氧化损伤的作用，有效减轻精子细胞受到的氧化应激损伤程度，保护精子的正常性能[10-12]。张树山研究也证实VE可提高精液冻存后的活率和顶体完整率[13]，本试验通过在稀释液中添加不同浓度 VE对驴精子进行低温保存，发现 VE的添加确实可以延长驴精子的存活时间，其中VE添加浓度为5%时保存效果最好，保存第十天时精子平均活率仍然接近0.30。

氧化石墨烯是石墨烯的衍生物，表面有很多羧基，可以很好地和大量带有正电荷的物质基团结合，比石墨烯的亲水性更强，氧化程度更高，被广泛应用于生物药学方面[14]。陈利萍等[15]研究也发现氧化石墨烯具有抗氧化的作用。中国科学院化学研究所王健君首次将氧化石墨烯作为抗氧化剂应用于低温冻存马精子，并发现具有很好的保存效果，马精子的活率从24.3%提高到71.3%。迄今为止，氧化石墨烯在哺乳动物精子保存方面的研究鲜见报道。本次试验通过在稀释液中添加不同浓度的氧化石墨烯对驴精子的低温保存效果进行研究，结果显示，添加氧化石墨烯的稀释液浓度为 30%时最适合精子的低温保存，在保存第八天时精子平均活率仍然接近0.30。