复发性流产免疫相关发病因素及研究进展

李琪雁，王轶英，汪田田，魏利

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）发病率占育龄期妇女妊娠的1%～5%，并呈逐渐增长趋势，且RSA患者再次妊娠的成功率只有20%～30%，严重威胁着女性身心健康。RSA病因复杂，除已经确定的染色体异常、解剖异常、内分泌异常外，约50%的RSA病因不明，多认为与免疫异常相关[1]。目前国际上将免疫异常RSA分为2类，一类是自身免疫型，主要与母体自身免疫性抗体产生有关；另一类是同种免疫型，主要与母-胎界面免疫耐受失衡有关。

1 自身免疫型RSA

自身免疫型RSA是指母体存在一些自身抗体，可以对胎儿及胎盘造成损伤。与RSA相关的自身抗体可分为组织非特异性抗体如抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，APA）、抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）等和组织特异性抗体如抗甲状腺抗体（antithyroid antibodies，ATA）、抗精子抗体（antisperm antibody，AsAb）等。以下将对相关抗体进行分述。

1.1 APA APA是一组能与含磷脂结构的抗原物质发生反应的自身抗体，主要包括抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）、抗β2糖蛋白Ⅰ（β2 glycoprotein I，β2GPI） 抗体和狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）等，临床上约5%～20%的RSA患者可检出APA，其中未经治疗者再次妊娠的活产率将降至10%[2]。国际指南将抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）列为RSA发生的高危因素，由欧洲30家医院合作开展的一项针对1 000例APS患者长达7年的队列研究结果显示，RSA的发生率为27%，在所有产科结局中居首位[3]。APA可引起胎盘血管内微血栓形成，胎盘缺血缺氧便容易发生流产，这种机制早在20世纪90年代就被众多学者接受，被认为是APA致RSA的经典途径。APA可与膜联蛋白、β2GPI等磷脂结合蛋白结合引发凝血功能紊乱促进血栓形成。Hayashi等[4]对膜联蛋白A5的基因型进行分析，发现膜联蛋白A5基因上游区域单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），尤其是位点rs1050606（-302T＞G）突变是RSA的危险因素。临床上对RSA合并APS的患者给予抗凝治疗可明显改善妊娠结局。一项评估阿司匹林和肝素对伴有APS的RSA患者治疗疗效的Meta分析结果显示，阿司匹林加肝素组或单独使用肝素组活产率较安慰剂对照组有明显改善（RR=1.23，P＜0.000 1；RR=1.18，P=0.02）[5]。APA还可以激活补体系统，募集单核细胞和中性粒细胞损伤滋养层细胞，并引发炎症的级联反应造成RSA[6]。一定程度的补体系统激活对正常妊娠是有必要的，但当补体过度激活时可以通过介导炎症损伤、调节特有免疫系统等影响胚胎发育而导致妊娠失改[7]。Girardi等[8]在APA阳性流产小鼠模型中发现其母胎界面存在明显的补体激活反应。Kim等[9]对系统性红斑狼疮（SLE）或APA阳性孕妇的补体激活产物进行检测并将其与妊娠结局进行分析，发现APA可以激活补体经典途径和替代途径，并提出早期妊娠检测补体系统激活产物Bb和补体膜攻击复合物sC5b-9水平可以作为不良妊娠结局的预测因素。

1.2 ANA ANA是一组以细胞核内成分（DNA、RNA、蛋白质等）为靶抗原的自身抗体。目前临床上已有多项研究资料表明RSA患者ANA阳性检出率高于正常妊娠妇女，提示ANA与RSA具有一定相关性。Sakthiswary等[10]研究结果显示RSA患者ANA阳性发生率明显高于健康对照组（35.3% vs. 13.3%，P=0.006），另外发现ANA效价与RSA发生次数呈正相关，但仍需大样本临床数据支持。有研究发现ANA阳性患者应用辅助生殖技术时，受孕率降低而流产率增加，由此推测，ANA在引发RSA和胚胎移植失败方面可能存在着相同的机制，即ANA可能产生对卵母细胞和胚胎发育有害的物质进而影响胚胎发育[11-12]。关于ANA引发RSA，有学者提出可能是ANA抗原抗体复合物沉积在胎盘或者蜕膜血管的表面，损害血管组织；不过也有学者认为ANA水平升高可激活免疫系统使母体产生炎症反应，降低子宫内膜对胚胎的容受性从而影响胚胎着床与发育，ANA与RSA相关仍需要更多免疫学证据[13-14]。

1.3 ATA ATA主要包括抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）、抗甲状腺球蛋白抗体（TG-Ab）、抗促甲状腺激素受体抗体（TR-Ab）等。Stagnaro-Green等[15]观察到部分RSA患者伴有血清ATA升高，甲状腺自身免疫（thyroid autoimmune，TAI）作为引起RSA的可能原因引起广泛关注，随后多项临床证据表明TAI与RSA具有一定关系。Lazzarin等[16]认为妊娠期孕妇对甲状腺激素的需求增加，而TAI引起的甲状腺功能异常不能满足孕妇对甲状腺激素的需要，并影响催乳素（prolactin，PRL）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）等激素的分泌，使体内性激素紊乱引发流产。当ATA水平异常时，甲状腺功能也可表现为正常，因此ATA引起甲状腺功能异常只能作为RSA的可能发病因素之一。Matalon等[17]在其制作的动物模型中发现，小鼠在注射了人甲状腺球蛋白产生抗甲状腺抗体后，甲状腺功能未受损伤，而胎盘及胚胎的质量较对照组却明显降低，且在胚胎组织中发现有抗体沉积，由此推测ATA导致RSA的原因可能是使胎盘直接受到损伤。Chen等[18]研究发现ATA通过降低程序性死亡配体1（programmed death ligand-1，PDL-1）抑制细胞外调节蛋白激酶/基质金属蛋白酶2（ERK/MMP-2）和MMP-9途径减弱胚胎滋养细胞的侵袭并最终导致流产。

1.4 其他类型自身免疫抗体 除上述抗体外，与RSA相关的抗体还有抗子宫内膜抗体（anti-endometrial antibodies，EmAb）、抗卵巢抗体（anti-ovarian antibodies，AoAb）、抗绒毛膜促性腺激素抗体（antihCG antibodies，hCGAb）、抗透明带抗体（anti-zona pellucida antibodies，ZpAb）等。目前认为它们与RSA的发生均有一定的关系，但具体机制尚需进一步探究。

2 同种免疫型RSA

胚胎被认为是一种同种半异体移植，其携带的基因有一半源自父亲，而胚胎却可以在母体内免受排斥维持正常的生长及发育，这与母-胎界面免疫耐受的形成密切相关。免疫耐受涉及体液免疫、细胞免疫、细胞因子等多方面，是一个精细复杂的免疫调节网络，各环节之间构成一种免疫平衡。一旦由于某种因素使免疫平衡被打破，胚胎遭受母体免疫攻击便可引发同种免疫型RSA。同种免疫型RSA可能与人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）异常、封闭抗体（blocking antibodies，BA）缺乏、自然杀伤（natural killer，NK）细胞数量或功能异常、辅助性T细胞17/调节性T细胞（Th17/Treg）平衡失衡、Th1/Th2细胞因子偏移等因素相关。

2.1 HLA异常与RSA HLA是6号染色体短臂上的一组具有高度多态性的连锁基因群，其编码的产物参与细胞间的相互识别并且诱导免疫应答，在移植免疫中发挥重要作用。一方面绒毛外滋养细胞（EVT）不表达经典的HLAⅠ类分子（HLA-A、HLAB）和HLAⅡ类分子（HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP），使胚胎可以免受母体同种异体反应性T淋巴细胞攻击；另一方面EVT选择性表达HLA-C、HLA-E、HLAF、HLA-G，可以维持和调节母胎免疫耐受，但是具体机制仍需更多更全面的研究[19-20]。目前认为当父母双方HLA位点相容性增大时，母体无法识别胚胎来自父系的抗原引发正常的免疫反应，胚胎便易遭受免疫排斥引发流产。Takakuwa等[21]对RSA夫妇和正常夫妇的HLA-DRB1、HLA-DQB1基因型进行检测，发现RSA夫妇2个以上等位基因错配的发生率明显高于正常夫妇（81%vs.67%，P=0.029），证明夫妻间HLA-Ⅱ类抗原的相容性增加可能参与RSA的发生。另外，母体HLA位点存在一些特异性疾病的易感基因或连锁单元体也可引发RSA获得诸多学者的关注。由于人群地域差异性及基因多态性，国内外各学者报道的易感基因不尽相同。Che等[22]研究证明长链非编码RNA（lncRNA）CCAT2中的rs6983267 G等位基因与中国华南地区反复流产的易感性降低相关。HLA分型与RSA的具体关系及各分型之间的相互作用尚需更深层次的研究。

2.2 BA缺乏与RSA BA主要是由HLAⅡ类分子和滋养细胞淋巴细胞交叉反应抗原（trophoblast-lymphocyte cross reaction antigen，TLX）等刺激母体免疫系统产生的一类IgG型抗体，是一种胚胎保护性抗体。早在1976年，Rocklin将BA缺乏与妊娠联系在一起，随后有多项研究证实BA与RSA存在一定关系[23]。BA可与母体淋巴细胞或胚胎滋养细胞表面抗原结合，覆盖来自父方的HLA抗原，从而封闭母体淋巴细胞对滋养层细胞的细胞毒作用[24]。另外，母体还可以针对BA产生一种独特型抗体，这种独特型抗体在母胎界面及体循环中与细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）、NK细胞等有害的免疫活性细胞相互作用，可以切断母体对胚胎的免疫应答。当夫妻双方HLA相容性大或具有相同的TLX时，来自父方的抗原不能刺激母体产生足够的BA，胚胎失去BA的保护便容易发生RSA。虽然对BA的研究已久，但是目前依然存在很多问题，究竟有哪些抗原可以引起BA产生尚无完整答案，BA是否可以作为RSA的一个致病因素也存在争议性。

2.3 细胞免疫与RSA

2.3.1 NK细胞 NK细胞是固有免疫系统中的核心细胞，具有杀伤靶细胞、分泌细胞因子等作用，在免疫环节中有重要作用。根据细胞表面CD56分子表达密度的不同，NK细胞可以分为CD56dim、CD56bright两种亚群，前者占NK细胞的90%左右，具有较强的杀伤活性；后者可产生多种细胞因子，具有免疫调节作用。外周血NK（peripheral NK，pNK）细胞主要以CD56dimCD16＋细胞为主，可直接发挥细胞毒作用，对胚胎具有损伤作用。子宫NK（uterine NK，uNK）细胞主要以CD56brightCD16－细胞为主，是妊娠早期免疫耐受的关键参与者，在促进滋养层细胞侵袭、子宫血管生成、母-胎界面免疫耐受维持等方面起着重要作用[25]。NK细胞的数量、活性及分泌功能改变均可能引起RSA。Ahmadi等[26]研究发现接受静脉内免疫球蛋白（IVIG）治疗的RSA患者pNK细胞百分比和细胞毒性显著降低（P＜0.000 1），而IVIG治疗组患者妊娠结局明显优于对照组（P=0.000 6），由此提出pNK细胞数量和功能状态可能作为IVIG治疗效应的重要预测因素。NK细胞表面激活和抑制性受体可调控NK细胞的活化状态并影响其分泌功能。有研究报道自然杀伤免疫球蛋白样受体（KIR）与滋养层表面HLAⅠ类分子（HLA-C、HLA-G）结合时可以刺激或抑制NK细胞产生可溶性因子，并表现出维持妊娠所需要的低细胞毒性[27]。Huang等[28]研究发现微小RNA-30e（miR-30e）可以通过调节NK细胞表面抑制性受体KIR2DL1和NK细胞活化性受体NKp44影响母-胎界面免疫耐受，推测其可能是RSA的潜在发病机制之一。此外，细胞调控分子T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）、白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）等可能也参与NK细胞功能的改变。

2.3.2 Treg细胞 Treg细胞是一组CD4+T细胞源性并高表达CD25分子的亚群，可以抑制自身反应性T细胞的活化，对免疫耐受的维持有重要作用，当Treg细胞减少或缺失时可引起母体对胎儿的免疫排斥导致RSA。Quan等[29]研究结果显示正常妊娠早期Treg细胞数量较非妊娠期增加，而自然流产患者蜕膜组织的Treg细胞数量较人工流产患者显著降低，证明Treg细胞对正常妊娠的维持具有保护作用。任何对Treg细胞有影响的因素都可能引发RSA，叉头样转录因子p3（Foxp3）作为Treg细胞特异性转录调节因子可以诱导CD4+T细胞分化为Treg。此外，研究发现PDL-1、转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素10（IL-10）和半乳糖凝集素1（Galectin-1）对Treg细胞也具有调节作用[30]。当IL-6存在时，初始化T细胞在TGF介导下由向Treg分化转向Th17分化。Th17是一类新的CD4+T亚群，能够分泌IL-17等细胞因子，参与炎性反应及自身免疫性疾病的发生。高水平的Treg细胞可以调节由于Th17增多引起的炎性免疫应答，二者构成一种平衡，在母胎免疫耐受和炎性免疫应答之间的调节中起着重要作用。Sereshki等[31]研究发现RSA患者体内Th17细胞及其细胞因子IL-17比例较正常组高，而Treg细胞数量较正常组低，证明Th17/Treg平衡以Th17为主时与RSA具有相关性。Lu等[32]对Th17/Treg平衡影响因素进行探讨，发现Nod样受体蛋白3（NLRP3）可以增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）的活性并增加IL-1β、IL-18的分泌调节Th17/Treg平衡，据此提出NLRP3炎症体可以作为未来RSA的一个治疗靶点。

2.3.3 其他细胞因子失衡或异常 1986年Mosmann等[33]通过T细胞克隆技术首先在小鼠中证实CD4+辅助性T细胞可分为Th1和Th2，各自分泌不同的细胞因子。随后Wegmann等[34]在大量实验的基础上发现孕鼠的母胎界面以Th2细胞因子为主，并提出正常妊娠的维持需要Th2细胞因子占优势。Th1细胞因子主要包括IL-2、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）等，可以抑制子宫内膜的分泌功能并介导细胞免疫反应和炎症反应使滋养细胞受损；Th2细胞因子主要包括IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β等，能够维持同种免疫耐受状态并抑制Th1细胞因子[35]。Th1/Th2平衡学说已广为接受，各种因素导致母体内细胞因子平衡向Th1偏移均有可能导致RSA发生。Jin等[36]发现Treg细胞可通过调控Th1/Th2平衡向Th2偏移，介导相关免疫耐受保证妊娠正常进行。而之前有研究发现缺乏Th2细胞因子的孕小鼠也不会全部发生流产，因此可以将Th17/Treg平衡视为Th1/Th2平衡的有利补充[37]。Saito等[38]提出将Th1/Th2平衡模式扩展为Th1/Th2/Th17/Treg平衡模式。另外，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）、吲哚胺2，3－双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）也是近年来关注度比较高的细胞因子。有研究报道，CTLA-4可与B7结合抑制T细胞的增殖、激活和分泌细胞因子的能力，并通过促进TGF-β的分泌减少IL-2的产生，负反馈调控T细胞反应[39]。Chang等[40]研究发现在RSA患者母胎界面IDO的表达水平低于正常妊娠，同时信号转导与转录激活因子3（STAT3）发生磷酸化并且MMP-9的表达量减少，由此推测IDO-STAT3通路异常可能与RSA有关，而Spinelli等[41]研究显示IDO的异常甲基化可能与妊娠失败有关。另外，近年来有学者提出可以通过检测细胞因子的水平预测流产的风险，但细胞因子失衡是仅发生在母体外周循环还是仅限于母胎界面亦或是二者皆有尚不明确，因此采用细胞因子作为流产的预测指标还有待进一步研究。

3 展望

虽然在众多学者的不断探索下，RSA免疫相关因素的“层层面纱”被相继揭开，但是母体全身的免疫以及母-胎界面局部的免疫本身就是一个涉及多种机制的复杂网络，不同机制各自独立又相互影响，我们现在的研究也许只是冰山一角。目前RSA缺乏高效的检测手段，而以淋巴细胞免疫疗法和静脉注射丙种球蛋白为主的免疫疗法的疗效和安全性尚存争议。与RSA相关的免疫因素仍需进一步研究与验证，以期为RSA的诊断和治疗提供更多的参考。