精子功能的生理机制及研究进展

任枚琪，杨瀚云，史潇

精子在男性生殖系统生成并获得运动能力后，还需在女性生殖道中经历超活化、获能、顶体反应、精卵识别等过程才能完成受精。其中任一环节受损均可导致受精障碍并影响妊娠结局。启动及激活精子功能是一个复杂的过程，涉及多种信号分子和信号通路。目前，对精子功能的理解尚不充分，对其进行深入研究能够为精子功能异常的诊断及治疗提供新的思路和研究方向。现从精子获能（capacitation）、顶体反应（acrosome reaction）、受精（fertilization）等方面综述精子功能的生理机制及研究进展。

1 精子获能的生理机制

获能是精子头部质膜起稳定作用的蛋白质和胆固醇的修饰或去除的过程，涉及质膜胆固醇外流、质膜重组、膜内外离子变化、蛋白酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排等多级信号传导及酶类激活反应。超活化（hyperactivation）运动是精子获能的前提，是精子进入雌性生殖道后发生的运动方式的改变，具体包括尾部呈“鞭打”状态，头部显现类似“8”字型的运动轨迹。超活化运动主要依赖细胞内Ca2+浓度增加及Na+、K+、H+的调节作用。细胞内Ca2+浓度增加后亦可启动精子获能。精子细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）也是获能启动因子之一。Ca2+和能刺激腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）合成环磷酸腺苷（cAMP）。ROS则通过增加cAMP水平、在细胞内启动细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路两种方式促进获能。另外，女性输卵管液中的高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）可直接诱导精子质膜表面胆固醇外流，进而触发多种信号通路参与促进精子获能。在获能相关信号通路中，最为主要的是cAMP-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路、ERK-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路以及内源性大麻素通路。

1.1 cAMP-PKA通路 在哺乳动物获能的过程中，精子细胞内Ca2+、、ROS和PKA均能激活AC合成cAMP，即cAMP-PKA信号通路。有研究提示PKA通过其调节亚基与A-激酶锚定蛋白（A-kinase anchoring proteins，AKAPs）连接，而AKAPs又能将蛋白激酶、磷酸酶及其靶蛋白固定在一定的细胞区域内，进而实现细胞内蛋白质中的酪氨酸残基磷酸化，简称蛋白酪氨酸磷酸化。蛋白酪氨酸磷酸化发生于精子鞭毛的所有部位，提示精子鞭毛的酪氨酸磷酸化提高了获能精子的运动能力。此外，还有研究提示缺乏PKA催化亚基（protein kinase A-Cα2，PKACα2）的小鼠精子不能完成受精[1]。因此，cAMP-PKA通路是精子获能中非常重要的一条信号通路。

1.2 ERK-MAPK通路 精子表面的蛋白酪氨酸磷酸化还可由ERK-MAPK通路驱动。虽然cAMPPKA和ERK-MAPK是精子获能中的2条平行通路，但ERK-MAPK通路还受到cAMP-PKA信号通路的间接调控[2]。研究表明，多种生长因子如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是有效的促分裂原，能够激活精子细胞ERK通路。此外，EGF与EGF受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的结合还能参与获能期间PKA-MAPK途径的蛋白酪氨酸磷酸化。

1.3 内源性大麻素通路 内源性大麻素系统不仅参与调控男性生殖系统中激素的释放，还参与精子获能。内源性大麻素主要包含花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酸甘油酯。在排卵周期中，AEA 能够通过激活大麻素受体1（cannabinoid receptor 1，CB1）和瞬时受体电位阳离子通道亚家族V 成员1 受体（transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）诱导牛精子的获能[3]。AEA涉及的信号传导途径包括刺激AC激活cAMP-PKA通路、刺激MAPK激活ERK-MAPK通路、调节细胞内Ca2+浓度以及调节一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）4种。

2 精子顶体反应的生理机制

顶体反应是精子在穿越卵丘细胞团间隙和透明带（zona pellucida，ZP）时顶体发生的一系列变化。精子头部与ZP相互识别结合，诱导精子顶体外膜与质膜融合，融合后顶体内释放的水解酶溶解ZP，帮助精子穿越ZP到达卵子表面并受精。顶体反应大致分为3个步骤：①顶体反应的启动；②顶体反应级联信号通路；③顶体外膜与质膜的融合。

2.1 顶体反应的启动 精子顶体反应的启动主要涉及顶体与ZP的相互识别。目前比较明确的识别方式主要有以下几种：①精子膜表面的半乳糖基转移酶（galactosyltransferase，Gal T）与透明带蛋白3（zona pellucida protein 3，ZP3）结合[4]；②活化的EGFR与ZP3结合[5]；③精子尾部的肌动蛋白结合蛋白（secretory actin-binding protein，SABP）与肌动蛋白结合，阻断肌动蛋白的聚合，引发精子顶体反应[6]。

2.2 顶体反应级联信号通路 在顶体反应级联信号通路中主要涉及以下几种分子的作用。

2.2.1 Ca2+的作用 在精子获能后质膜表面的Ca2+通道打开，促使质膜外Ca2+内流[7]。细胞内的Ca2+可与AC结合并激发下游cAMP-被cAMP直接激活的交换蛋白（Epac）通路，即cAMP-Epac通路促使位于顶体外膜和质膜之间的F-肌动蛋白解聚成G-肌动蛋白单体，促进顶体外膜和质膜直接接触，诱发顶体反应[8]。

2.2.2 G蛋白的作用 G蛋白即鸟嘌呤核苷酸调节蛋白（guanine-binding regulatory proteins，G-proteins）。精子膜上的G蛋白与ZP3相互识别后，G蛋白耦联的磷脂酶Cβ1（phospholipase Cβ1，PLCβ1）受体可以与跨膜AC结合并激活AC[9]，AC将底物三磷酸腺苷 （adenosine triphosphate，ATP） 转变成cAMP，cAMP作用于PKA独特的催化亚基Calpha2，进而激活PKA[10]。激活的PKA通过激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl-inositol-3-kinase，PI3K） 和磷脂酶D（phospholipase D，PLD）来增强肌动蛋白的聚合作用，进而保护精子免受自发性顶体反应（spontaneous acrosome reaction）的侵害，防止自发性顶体反应降低受精率[11]。与此同时，cAMP可激活精子特异性Na+-H+交换装置[12]，提高细胞内pH值，从而进一步促进质膜外Ca2+内流[13]。

2.2.3 Epac蛋白的作用 Epac由羧基末端的催化区和氨基末端的调节区组成。Epac具有cAMP结合域，在无cAMP的情况下，调节区域可通过覆盖CDC25同源结构域阻止底物接近催化位点来抑制Epac的酶活性；结合cAMP后，构象的改变使调节区发生位置改变，暴露出催化位点，解除了抑制作用。暴露出的催化区可通过催化激活鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）蛋白超家族中Rap亚家族的GTP酶Rap1蛋白（guanosine triphosphate pase Rap1，GTPase Rap1） 和Rab亚家族中的Rab 3A蛋白（Rab 3A protein）诱导顶体反应。被激活的GTPase Rap1可将鸟嘌呤二核苷酸（guanosine diphosphate，GDP）转化为鸟嘌呤三核苷酸（guanosine triphosphate，GTP），与此同时激活Rap1蛋白下游耦联的PLC[14]。PLC水解磷脂酰肌醇-4，5－双磷酸（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）产生1，4，5-三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3），IP3可打开门控通道动员细胞内钙[15]。而被激活的Rab3A则介导了膜融合过程。

2.2.4 PLC的作用 在顶体反应过程中，PLC在Rap蛋白上游和下游均起作用，因为其具有2种催化活性——鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）活性和水解PIP2活性[16]。GEF是激活Rap的重要因子，因此PLC的GEF活性可在Rap上游发挥作用激活Rap，将胞外、胞内信号耦联至Rap；同时位于Rap下游的PLC又能够水解精子质膜上的PIP2，生成IP3、二酰基甘油（diacylglycerols，DAG）。DAG可提高膜的流动性，IP3则可通过级联放大作用，使质膜内钙释放[17]，保证了Rap信号的正常传递。

2.2.5 EGF的作用 EGF表现出双重作用，在精子获能过程中其可促进F-肌动蛋白的形成，而在顶体反应中，精子F-肌动蛋白已达较高水平，此时的EGF则会促使F-肌动蛋白分解，诱发顶体反应[18]。

2.3 顶体外膜与质膜的融合 顶体外膜与质膜融合主要涉及以下几种信号的分子作用。

2.3.1 Rab蛋白的作用 Rab蛋白是单体G蛋白Ras超家族中最大的成员，定位于精子的头部和尾部，是细胞内囊泡运输的重要调节因子[19]。大量实验表明Rab3A可激活位于其下游的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs），其中PTP1B作为PTPs家族的成员，可以使P-N-乙基马来酰亚胺敏感因子 （P-N-ethylmaleimide-sensitive factor，P-NSF）脱磷酸生成NSF，NSF与可溶性NSF附着蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）协同可使顶体外膜和质膜实现物理连接，以完成其膜融合组装的功能[20]。

2.3.2 SNARE蛋白的作用 SNARE蛋白是一个20～30 ku的蛋白质家族，多固定在膜上或与膜结合。其介导的膜融合过程是囊泡运输的最后一步，也是整个膜融合过程的核心[21]。由于精子质膜及顶体外膜具有脂质双层结构，其头部亲水性基团和尾部疏水性烃链高度稳定，所以膜融合过程要跨越巨大的能量屏障。而当两层膜靠近时，NSF与可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白（soluble NSF adaptor protein，SNAP）可催化SNARE复合物的分解[22]，释放巨大的自由能，为膜融合提供能量[23]。同时SNARE单体能够在细胞骨架的协助下把两层膜拉到一起，真正实现顶体外膜和质膜的融合。

精子顶体反应的生理机制如图1所示。位于精子质膜上的Gal T、G蛋白、EGFR等可以与卵子表面ZP3等蛋白相互结合，介导精子质膜与透明带识别，启动顶体反应。同时，女性卵泡液、孕酮等也可通过诱导精子细胞内Ca2+增加诱导顶体反应。精子内Ca2+增加以及G蛋白与PLCβ1受体的耦联激活AC，并将ATP转变成cAMP。cAMP可通过cAMP-PKA（依赖PKA）通路和cAMP-Epac（不依赖PKA）通路启动级联信号反应。在cAMP-PKA通路中，cAMP在激活PKA的同时，还可激活Na+-H+交换装置，提高细胞内pH值，促进质膜外Ca2+内流。在cAMP-Epac通路中，cAMP激活Epac，进而激活Rap1和Rab3A，Rap1下游的PLC可与PKA协同，将PIP2水解为IP3、DAG，触发顶体外膜上的Ca2+通道，促使内钙释放。与此同时Rab3A下游的PTP1B可催化P-NSF脱磷酸，所生成的NSF与SNAP可将SNARE复合物水解为SNARE单体，水解过程所释放的巨大自由能可帮助SANRE单体诱导顶体外膜和质膜实现物理连接，完成顶体反应。与此同时，位于精子质膜与顶体外膜之间的SABP通过结合AP，可阻断AP聚合，诱导顶体反应发生。

3 精子受精的生理机制

受精是指成熟的精子进入卵子内，与卵子融合成为合子的过程。顶体反应后卵丘细胞层被溶解，精子头部的透明带结合蛋白与ZP相互结合，保证精子锚定在卵子上，为进一步溶解ZP做好准备；接着精子溶解ZP进入卵周膜间隙，精子头部识别并结合卵子细胞膜表面的蛋白，诱导精卵膜融合[24]。膜融合的成功是精子将遗传物质输入卵细胞的保证，也是受精过程最重要的一步。受精涉及精子和卵子表面的多种受精相关蛋白，分子机制十分复杂，具体过程尚未完全阐明。精子表面介导受精的分子主要有以下几种。

图1 顶体反应的信号通路图

3.1 整联蛋白金属蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinase，ADAM） 该家族成员多在哺乳动物的睾丸和附睾中表达[25]。ADAM1a、ADAM2和ADAM3基因缺陷小鼠的精子与ZP的黏附结合减少，且ADAM2缺陷型精子无法与卵母细胞质膜完成融合[26]。由α和β亚基组成的整合素（Integrin）同样属于整联蛋白家族，但却多表达于卵母细胞表面。采用抗整合素β1亚基抗体可显著抑制ADAM2与卵细胞的结合，进而抑制精卵细胞间的黏附及精卵融合[27]，说明ADAM与Integrin之间的结合介导精卵黏附和融合。

3.2 Izumo1 其是具有单个跨膜结构域的免疫球蛋白超家族成员。顶体反应后Izumo1从顶体膜向精子表面扩散并逐渐聚集于精子质膜赤道段[28]，敲除Izumo1基因后的小鼠不育[29]。卵子表面的Juno是叶酸受体家族蛋白同源物，Bianchi等[30]以Izumo1结构域为结合探针，发现Izumo1结构域与Juno的胞外域存在强相互作用，且敲除Juno基因的雌鼠，其卵子无法与成熟的精子结合，说明Izumo1-Juno蛋白对在受精过程中发挥了重要作用[31]。

3.3 热休克蛋白A2 （heat shock protein A2，HSPA2）-精子头部黏附因子（sperm adhesion molecule 1，SPAM1） 精子HSPA2是热休克蛋白家族成员，参与蛋白复合物的折叠、运输和组装[32]。研究表明HSPA2可通过协调精子头部结构域的重塑以及与SPAM1形成识别复合物来介导精卵间的识别[33]。其在成熟精子中的含量与精卵细胞结合紧密相关[34]。

3.4 精子赤道片段蛋白（sperm equatorial segment proteins，SPESPs） 其是由一种睾丸特有的减数分裂后基因所编码的蛋白，分布于精子的赤道部分，能够与无透明带的卵母细胞结合。敲除小鼠SPESP1基因或使用抗SPESP1抗体，均能显著抑制精卵膜融合[35]。

3.5 半胱氨酸分泌蛋白（cysteine-rich secretory proteins，CRISP） CRISP家族成员主要存在于附睾中，能够通过与卵母细胞表面互补位点的相互作用参与精卵融合[36]。其中人类附睾CRISP1是一种多功能蛋白，不仅通过卵母细胞互补位点参与精卵融合，还可与ZP3特异性相互作用，参与精子与透明带的结合[37]。大鼠实验发现，在精卵结合过程中CRISP2可与CRISP1互相协作，以确保受精[38]。

4 结语

正常精子功能的实现过程十分复杂，精子细胞内Ca2+浓度增加以及cAMP的合成增加是实现精子功能的核心环节，涉及到大量信号分子和信号通路的正确运行。对精子功能的生理机制进行深入研究有益于临床精子功能异常患者的治疗。未来的研究应着重探索在体内条件下精子与女性生殖道相互作用时精子功能的变化情况，以及可能的治疗靶点。