线粒体异常与复发性流产

黄慧群，陆浩天，纪冬梅

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续发生两次或两次以上的自然流产[1]，育龄期女性发生率为1%～5%，RSA患者再次妊娠的自然流产发生率可高达70%～80%，对患者的身体状态和心理健康都会造成难以弥补的危害。线粒体存在于绝大多数真核细胞中的细胞器，其不仅通过氧化磷酸化产生大量ATP，为细胞的正常生命活动提供能量，还参与介导细胞凋亡、钙离子调控和信号转导等过程[2]。卵母细胞是人体内线粒体含量最为丰富的细胞，线粒体为卵子发生、受精以及胚胎发育提供能量。据研究报道，RSA的发生可能与线粒体氧化磷酸化功能异常和细胞凋亡有关[3]。本文将对线粒体结构和数量异常导致的线粒体功能缺陷与RSA发生发展的关系进行综述。

1 线粒体的结构与功能

线粒体是一种普遍存在于除红细胞外的真核细胞中的细胞器，含有自身独立的遗传物质，即线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。人类mtDNA是16 kb的环状双链DNA，包含37个结构基因：编码呼吸链中的13种蛋白质，合成线粒体蛋白质所需的2个核糖体RNA（rRNA）和22个转运RNA（tRNA）以及一段非编码区即D环（D-loop），其中D-Loop区是mtDNA轻链和重链序列的启动子，主要负责调控mtDNA的复制与转录[4]。MtDNA发生任何变异都有可能导致线粒体氧化损伤、凋亡和缺氧，从而引发疾病。

目前发现的线粒体功能包括：通过氧化磷酸化产生ATP为细胞提供能量，调节细胞膜点位并控制细胞凋亡，维持钙离子平衡，参与细胞增殖与细胞代谢调控等[3]。线粒体在高能耗过程中（如细胞的增殖和发育）发挥重要作用，这些作用是通过氧化磷酸化反应产生ATP来实现的。线粒体的氧化呼吸以及调控细胞凋亡功能异常可能是导致RSA发生的主要原因。母系遗传的线粒体是人类卵母细胞和早期胚胎中最丰富的细胞器，其功能异常可深刻影响卵母细胞和早期胚胎ATP的生成水平，进而导致染色体异常分离或发育停滞[3]。有研究也表明卵母细胞mtDNA的缺失和突变可能会导致某些不孕妇女和育龄妇女代谢缺陷或复制障碍[5]。

2 MtDNA异常与RSA

MtDNA出现异常时，其自我复制和编码蛋白的功能出现障碍，导致线粒体氧化呼吸、介导细胞凋亡等正常生理功能出现异常，继而引发疾病。据研究报道，mtDNA的突变和拷贝数异常与RSA密切相关。

2.1 MtDNA拷贝数与RSA MtDNA拷贝数是指细胞内mtDNA的分子数量，是细胞内mtDNA水平的一种度量方式，其与ATP的生成和线粒体酶活性等密切相关，可作为衡量线粒体功能的生物标记物[6]。又因为线粒体母系遗传的特性，加上其易于获取和检测[6]，mtDNA拷贝数常被用于评估卵母细胞质量和胚胎发育潜能。

很多研究数据显示，在发育异常的受精卵和早期胚胎中，mtDNA拷贝数明显降低[7-8]。Murakoshi等[9]进行的RSA动物实验和Desquiret-Dumas等[10]进行卵母细胞检测结果均发现，mtDNA拷贝数增加可以提高卵母细胞的质量和胚胎的生存能力，改善妊娠结局。有报道明确指出，mtDNA拷贝数可能是胚胎存活的重要决定因素，拷贝数过低可能影响卵母细胞功能和早期胚胎发育，导致发育停滞，引发RSA[3]。因此推测，mtDNA拷贝数低下会导致线粒体的活性减低、能量生成减少，导致卵母细胞质量下降，早期胚胎发育障碍，诱导RSA的发生发展。还有学者提出了卵母细胞质量的线粒体阈值理论[11]，即人类卵母细胞mtDNA拷贝数达到某一阈值才能确保正常的受精和胚胎发育，这一阈值是保证线粒体具有一定活性或线粒体能生成所必须的ATP数量的最低拷贝数，而任何卵母细胞mtDNA拷贝数一旦低于这个阈值即可导致发育受损，但目前这一理论还未得到统一认可。

然而近几年来，越来越多的研究都发现了一个相反的现象：胚胎细胞中mtDNA拷贝数升高，胚胎植入率和妊娠率大大降低，胚胎流产率增加[12]。异常升高的mtDNA拷贝数胚胎植入失败率甚至达到100%[13]。对于这一相对矛盾的现象，研究者也给出了一些解释和推测。Leese[14]提出的“安静胚胎假说”：正常可存活的胚胎是处于一个相对较低或“安静”的新陈代谢状态，mtDNA拷贝数较低，而那些发育潜能降低的胚胎，新陈代谢反而更活跃，mtDNA异常升高。线粒体/mtDNA的一种代偿机制：现有的线粒体功能出现异常，为维持正常的能量供应，mtDNA拷贝数代偿性增高[15]。较高的mtDNA拷贝数可能会导致其偏离某种稳定状态和平衡条件，引起非整倍体[16]、化学诱导应激[17]、mtDNA突变[17]等不良后果，继而导致胚胎植入失败和流产的发生。此外，Viotti等[18]还提出一个令人困惑的问题，线粒体可以包含大量的mtDNA拷贝数，但mtDNA拷贝数高并不等于有大量的有功能的线粒体产生。同时他还指出，线粒体数量增加也并不一定意味其功能或代谢活动增加。

故目前为止关于mtDNA拷贝数异常与卵母细胞和胚胎发育之间的关系尚存在争议，具体的机制仍不得而知，mtDNA拷贝数与RSA相关性仍需要进一步探索与研究。

2.2 MtDNA突变与RSA 线粒体是一种半自主性的细胞器，自身有一套遗传物质，功能受核DNA与mtDNA的共同调控，但mtDNA突变率远远高于核DNA，加之其缺乏良好的保护和修复机制，且暴露于氧化呼吸链的应激状态下，极易因突变而受到损害[15]。MtDNA突变累积到一定程度可导致编码呼吸链相关蛋白的功能受抑制，mtDNA复制出现障碍[19]，从而影响线粒体的功能，由于线粒体独特的母系遗传特点，突变累积对RSA的发生发展也会产生影响。很多研究都显示，RSA患者的mtDNA突变频率高于一般的妊娠妇女[3,5,20-21]。例如，Kaare等[3]用变性高效液相色谱法（DHPLC）在RSA患者外周血中就检测到19种不同于正常妊娠妇女的mtDNA异质性变异；此外，他们还收集并分析了来自RSA患者的8个胎盘样品，并发现胎盘样品中的mtDNA突变比例比母体更高。这些都提示着mtDNA突变与RSA发生发展息息相关。

此外，mtDNA突变累积影响线粒体氧化呼吸功能，造成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，进一步加重mtDNA的损伤，导致恶性循环加速细胞凋亡，从而引发RSA[19,22]。当mtDNA突变致线粒体氧化磷酸化功能异常时，ATP生成减少，不能支持卵母细胞增殖过程中染色体正常分离，导致非整倍体胚胎形成，而非整倍体胚胎是引发RSA的关键因素之一[23]。

值得一提的是，mtDNA突变本应该是随机的，可以发生在任何部位，但最近几项研究[3,24]发现，RSA患者中的mtDNA突变更偏爱聚集在非编码区的DLOOP和编码区的线粒体NADH 脱氢酶亚单位1（MT-ND1）、MT-ND5的区域，其中以D-LOOP区突变最为常见。MT-ND1和MT-ND5基因是编码氧化呼吸链的亚基，其突变累积超过一定阈值会造成线粒体呼吸链功能出现异常，并可能影响ATP的生成，形成氧化应激而诱发RSA，有研究表明这些基因突变与RSA的发生发展密切相关[25-26]。D-LOOP区调节mtDNA的复制和转录，该区域突变会影响mtDNA拷贝数和编码蛋白的功能，并可能干扰氧化磷酸化功能影响ATP的产生，使卵母细胞和胚胎发育能力下降导致流产，亦有文献报道D-LOOP区突变与RSA密切相关[27-29]。不过以上观点都仍需要更多的研究来支持和证实。

3 线粒体氧化磷酸化异常与RSA

3.1 ATP与RSA 线粒体在卵母细胞和早期胚胎细胞中的核心作用就是氧化呼吸生成ATP，为正常的卵母细胞生命活动和良好的胚胎发育提供充足的能量来源[30]。一旦线粒体的氧化呼吸功能出现异常，ATP生成减少，细胞的能量供需就会失衡，导致卵母细胞和早期胚胎的代谢活动障碍，也可能引起一系列的发育异常，如染色体分离障碍，形成非整倍体细胞；卵母细胞质量下降；细胞的分裂异常；胚胎植入和发育失败等[31]，而这些也是引发RSA的关键因素。对ATP含量与卵母细胞和个体生育潜能关系的研究发现，妊娠组卵母细胞和胚胎的ATP含量均明显高于未妊娠组[32]。另一研究向52周鼠龄的ICR鼠补充可增加卵母细胞线粒体ATP合成的辅酶后，卵母细胞数量和受损卵母细胞线粒体功能都有明显提高[33]。上述研究提示ATP生成的减少可能会导致流产的发生。

基于这一认识，研究人员也提出了各种方法改善线粒体功能、提高ATP含量，提高卵母细胞的质量和胚胎的发育能力。其中辅酶Q10是一种普遍存在的自由基清除剂，也是线粒体呼吸链中产生ATP的关键成分，目前被提出作为一种补充物改善卵母细胞质量，可提高妊娠率[34]。Heydarnejad等[35]发现，在成熟的培养基中添加辅酶Q10可改善线粒体功能，提高ATP含量，增加囊胚形成率和孵化率，提高绵羊卵母细胞的发育能力。该研究结果在牛[36]、小鼠[37]等动物实验中也得到了验证。但是目前关于ATP含量对RSA直接作用的实验证据还不充分，基于提高ATP含量的治疗方案还有待进一步研究。

3.2 ROS与RSA ROS是线粒体经氧化代谢产生的物质，生理浓度的ROS是许多细胞功能的调节剂，起着重要作用，但过量的ROS会造成细胞器和大分子物质损害，如损害线粒体、水解肽链、氧化损伤DNA等，产生细胞毒性。而抗氧化物质[主要为还原性谷胱甘肽（GSH）]则负责还原ROS，因此正常体内的活性氧与抗氧化物质往往保持动态平衡。当线粒体氧化磷酸化异常产生过量ROS时，正常量GSH无法代偿，机体处于氧化应激状态，而这种氧化应激状态会造成卵母细胞质量下降，胚胎发育异常，诱发流产[38]。

很多研究均发现RSA与ROS以及ROS异常所造成的氧化应激密切相关，比如与正常妊娠妇女相比，RSA患者的细胞内ROS水平显著升高；将RSA患者的血浆、全血和胎盘组织与正常妊娠妇女进行对比，发现前者的抗氧化物质氧化性谷胱甘肽比例（GSH/GSSG）明显降低，过量的ROS会导致细胞损伤，造成RSA[39]。此外，RSA孕妇的男性伴侣常伴有精子质量下降，研究表明其内分泌功能受损，精子ROS水平升高，DNA受损，而精子DNA在胎盘形成中起关键作用，也可能是导致RSA的关键因素之一[40]。

此外，ROS与RSA的关系在动物试验中也有很大的进展。已知秀丽隐杆线虫存在一种突变体，编号为mev-1，其假定突变基因位cyt-1（与人类和实验小鼠SDHC基因同源）的表达会导致体内ROS水平异常升高，为模拟机体高ROS水平，Ishii等[41]建立了一组mev-1模拟转基因小鼠，其SDHC突变基因导致缬氨酸被69位的谷氨酸取代，相当于秀丽隐杆线虫的mev-1突变体。研究表明体内高ROS的Tet-mev-1小鼠外周血中血小板数量明显增高且脾脏异常肿大，导致平均怀孕13.5 d的Tet-mev-1小鼠容易发生血栓、胎盘发炎症状从而导致复发性流产。此外，Tet-mev-1小鼠的血管内皮生长因子受体1（Flt-1）表达较少，胎盘内血管异常增生，表现为胎儿和新生儿常因发育停滞而死亡[41]。

3.3 细胞凋亡（线粒体途径）与RSA 细胞凋亡即细胞的一种程序性死亡，是一种生理现象，胎盘绒毛在正常的生长发育过程中均离不开其参与。细胞的内在凋亡途径是其程序性死亡的经典形式，而线粒体则是内在凋亡途径的中心，在细胞凋亡的发生中发挥重要且普遍的作用[42]。线粒体途径的细胞凋亡主要受到Bax/Bcl-2基因的调控以及BAK和Bax两种蛋白介导，BAK和Bax蛋白为促凋亡蛋白，它们被激活会导致线粒体外膜通透性增加，细胞色素C释放入细胞质中，与其他物质结合后形成凋亡小体，进而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，最终介导和促进细胞凋亡[42-43]。相反，Bcl-2蛋白家族具有介导线粒体的完整性和抑制BAK和Bax蛋白的作用，对细胞凋亡具有抗凋亡活性[42]。在正常妊娠的情况下，蜕膜组织和胎盘绒毛的细胞增殖与细胞凋亡之间存在一种平衡[44]。但当蜕膜组织中具有抗凋亡活性的基因Bcl-2的表达明显降低时，对促凋亡的BAK和Bax两种蛋白表达的抑制能力也大大降低，线粒体出现异常，激活细胞凋亡级联的能力受到干扰，线粒体途径的细胞凋亡水平会明显升高，细胞增殖与凋亡之间的平衡也不复存在，继而诱导自然流产和RSA等妊娠疾病的发生。Sun等[44]的研究也发现RSA患者的滋养层细胞形态较普通流产患者有较大变化。例如，RSA患者滋养层细胞核仁消失，核固缩、裂解，并可见典型的含有线粒体等细胞器的凋亡小体，呈典型的细胞凋亡形态；其线粒体也出现明显异常，比如变得肿胀、线粒体鞘减少、排列不规则，普通流产患者则基本无上述变化。由此可见，线粒体异常所导致的细胞凋亡也与RSA的发生有显著关系。同时，滋养细胞的侵袭也会受蜕膜组织中过度细胞凋亡的影响，而滋养细胞侵袭障碍又影响到胚胎的植入，最终发生流产[45]。

4 结语

以上所述的线粒体功能障碍，mtDNA异常与RSA之间的相关性都表明了线粒体在RSA发生、发展中的重要作用。相信通过不断深入探索和研究两者之间的关系，基于线粒体的RSA治疗方案亦会发挥十分重要的作用，更有效地帮助RSA患者顺利获得健康子代，人类在追求优生优育的道路上也能更进一步！