长链非编码RNA与非酒精性脂肪性肝病

张贺 杨立英 黄雯莉 王文昭 陈素凤 任路平

1河北医科大学，石家庄 050017; 2河北省人民医院内分泌代谢病一区，石家庄 050051

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种常见的慢性肝脏疾病，目前已经成为全球最常见的肝病之一。肝细胞脂代谢失衡是NAFLD发生、发展的主要原因，长链非编码RNA (lncRNA)主要通过调控基因，进而对肝脏脂代谢发挥作用[1]。本文综述了lncRNA与NAFLD的相关研究，对临床治疗和疾病预防具有重要意义。

1 NAFLD概述

NAFLD主要包括4个组织学阶段，即简单脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、纤维化和肝硬化。简单脂肪变性是良性肝脏疾病，可以在几十年里缓慢恶化，而非酒精性脂肪性肝炎则可在短期内进展为肝硬化甚至肝细胞癌。肝细胞癌的发病率正在上升，在西方国家，肝细胞癌患者中NAFLD比率可能占到病例的25%，而且这种关联可能更高[2]。

NAFLD发病机制复杂，单纯性脂肪肝发病机制主要包括胰岛素抵抗和脂代谢紊乱。最普遍、最流行的假设是所谓的“二次打击”学说[3]。第一次打击源于胰岛素抵抗伴随着脂肪蓄积，在此基础上诱发的各种炎性细胞因子(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6等)，以及脂肪因子(瘦素、脂联素、抵抗素)，从而导致肝脏炎性反应和肝细胞损伤，称为第二次打击[4]。

2 LncRNA概述

LncRNA是一组具有有限编码能力的长度超过200个核苷酸的RNA分子，具有多种功能并通过各种分子机制调节不同的生物过程[5]。研究表明，lncRNA可以通过调节microRNA，在人类的各种疾病中发挥关键作用[6]。根据lncRNA基因在基因组上的位置,可将其分为3类：(1)位于基因间区的lncRNA，又被称作lincRNA。(2)天然反义链lncRNA。(3)内含子区长链非编码RNA[7]。近年来研究表明，lncRNA是多种生物过程的重要调控因子，广泛参与了许多生物学过程。

3 LncRNA与NAFLD

3.1 通过抑制脂肪酸β-氧化促进肝脏脂肪变性 LncRNA类固醇受体RNA激活剂(LncRNA-SRA)是一种lncRNA，在调节细胞增殖中起关键作用。LncRNA-SRA作为一种RNA共激活剂，可增强类固醇核受体依赖基因的表达[8]。在肌细胞生成、类固醇受体生成、乳腺肿瘤发生、心肌病等方面发挥重要作用。脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)是主要的肝脏甘油三酯水解酶，它在游离脂肪酸的分解和信号控制中起着不可或缺的作用[9-10]。ATGL可调节细胞中甘油三酯水解酶的活性，是血脂异常和脂肪肝的可能治疗靶点[11]。为了评估lncRNA-SRA在体内的功能，Chen等[12]建立了SRA1基因敲除(SRA KO)小鼠模型。结果发现，SRA KO小鼠在高脂饮食和正常食物喂养下肝脏ATGL的基因和蛋白表达上调。表明lncRNA-SRA缺乏会上调ATGL在肝脏的表达。此外，在SRA KO小鼠肝细胞中诱导ATGL表达，使肝细胞酮体生成增加，而酮体是脂肪酸β氧化的产物和指标，从而改善了肝脂肪变性。在肝细胞Hepa1-6细胞系中，内源性SRA的敲低也得到了类似的结果。相反，SRA的过表达抑制了ATGL的表达并减少了脂肪酸β氧化。并且小鼠肝脏ATGL缺乏可引起进行性肝脏脂肪变性。

3.2 通过促进肝脏脂质合成，导致肝脏脂质沉积 固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)是具有甘油三酯合成转录活性的SREBP家族成员，参与编码了催化脂肪酸和甘油三酯合成途径中各个步骤的酶，如脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)1[13]。SREBP-1c促进脂肪酸合成，异常表达的SREBP-1c可引起肝脏甘油三酯升高和肝脂肪变性[14]。

肝脏脂代谢与脂质摄取、脂质从头合成、脂肪酸氧化和脂蛋白分泌有关。在NAFLD中，脂质从头合成通路的功能障碍与原发性疾病有关。LncARSR是近期发现的具有591个核苷酸的lncRNA，其在肿瘤中扮演着重要角色。为了阐明lncARSR影响的机制，Zhang等[15]使用腺病毒通过尾静脉注射入小鼠体内，建立了lncARSR过表达和敲低小鼠模型，与对照组相比，lncARSR过表达组小鼠脏肝甘油三酯含量增加，脂肪生成相关的关键基因[SREBP-1c、FAS、ACC1、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD-1)]的mRNA表达水平增加，而lncARSR敲低组呈现相反的趋势。表明lncARSR可通过促进肝脏脂质合成导致NAFLD。

富含棕色脂肪的lncRNA 1(Blnc1)具有调节棕色和米色脂肪细胞分化的能力[16]。Zhao等[17]发现高脂饮食喂养的小鼠肝脏中Blnc1表达显著升高，通过免疫印迹和实时定量PCR分析显示Blnc1可以诱导SREBP-1c的前体以及脂质合成基因的表达，包括SREBP-1c、FAS和SCD-1。分别对对照组和高脂饮食组小鼠进行Blnc1基因敲除，结果发现，与对照组相比，Blnc1基因敲除小鼠的肝脏重量、甘油三酯和胆固醇含量显著降低。肝基因表达分析表明，参与脂质合成关键基因的mRNA水平显著降低，脂质合成相关基因受到明显抑制。这些结果表明，Blnc1是肥胖相关的脂肪形成活化以及高脂饮食诱导的肝脂肪变性发展的必要条件。

3.3 通过调节microRNA在NAFLD中发挥作用 目前，很多研究发现lncRNA可以通过调节microRNA对下游靶基因起调控作用，从而影响脂代谢通路的上游或下游因子的表达，最终导致脂质沉积。核富集丰富的转录物1(NEAT1)是一种lncRNA，Sun等[18]采用高脂饮食诱导的小鼠和游离脂肪酸处理的HepG2细胞，建立体内外模型。评估两种NAFLD模型中NEAT1的mRNA水平。结果发现，NEAT1和miRNA-140均在两种NAFLD模型中上调。表明miRNA-140-NEAT1轴在NAFLD中被激活。动物实验发现miRNA-140或NEAT1沉默可缓解NAFLD。为进一步验证这些结论，他们将sh-miRNA-140转染到HepG2细胞来抑制miRNA-140的表达，发现sh-miRNA-140在降低细胞内miRNA-140的表达同时，也可降低NEAT1的表达。此外，转染sh-NEAT1可显著降低miRNA-140的表达，同时细胞内甘油三酯含量明显下降，油红O染色显示细胞内脂滴空泡减少，脂质合成上下游因子蛋白表达降低。提示lncRNA NEAT1通过调节miRNA-140在NAFLD中发挥了一定作用。

LncRNA-H19是第一个被发现的lncRNA，具有多种多样的生物学功能，参与细胞增殖、分化和代谢的调控[19]。Liu等[20]研究发现，在HepG2和Huh-7细胞中用H19 shRNA对H19进行抑制，发现miRNA-130a在H19敲低细胞中增加。为了确定H19是否直接调节miRNA-130a，构建了野生型H19的荧光素酶报告载体(H19-WT)和突变体形式(H19-MUT)以进行双重荧光素酶报道试剂测定。结果表明，H19与miRNA-130a在这个假定的结合位点直接相互作用，并且H19可以负调控miRNA-130a的表达。为了探索miRNA-130a对肝脂肪变性的作用，他们使用miRNA-130a模拟物和miRNA-130a抑制剂处理游离脂肪酸诱导的HepG2和Huh-7细胞，结果发现，与游离脂肪酸组相比，在用miRNA-130a模拟物处理的游离脂肪酸诱导的细胞中，与脂肪生成相关的基因包括过氧化物酶体增殖物活化受体γ、SREBP-1c、SCD-1、ACC1和FAS均下调，而在miRNA-130a抑制剂组中则显著上调。因此，认为lncRNA-H19通过下调miRNA-130a的表达来促进脂质沉积，从而导致NAFLD。

3.4 LncRNA基因表达谱与NAFLD Sookoi等[21]利用第二代测序技术对与基因组中随机选择的lncRNA区域相关的遗传变异进行全面分析，发现lncRNA(lnc-JAM2-6)中rs2829145A/G与NAFLD严重程度相关。

Sun等[22]通过对10例胆囊结石患者肝脏取样进行微阵列分析，发现在正常对照和NAFLD组肝脏中lncRNA表达谱存在差异。GO和pathway分析表明，这些差异表达的lncRNA可能参与了NAFLD的发生、发展，可能有助于阐明NAFLD的分子机制。随后他们选取7个lncRNA进行验证。结果发现，基因芯片数据与PCR定量一致，提示这些lncRNA可能作为NAFLD诊断的生物标志物。

综上所述，lncRNA对NAFLD影响途径广泛，包括直接调节靶基因对下游脂质合成、脂肪酸β氧化基因产生作用，亦或是通过microRNA调节靶基因对下游脂代谢因子发挥作用，还是对基因表观遗传的调节，都可以影响NAFLD的发生、发展进程。然而NAFLD的发病机制复杂，目前最广泛的是“二次打击”学说，其发病机制尚不清楚。人们对lncRNA的认识也十分有限，对其功能和作用机制仍不完全清楚。LncRNA从实验室走向临床应用仍需要一段探索过程，对于lncRNA与NAFLD关系的研究近年来虽然有了快速的发展, 但仍有大量的问题亟待解决。