纳米纤维素/壳聚糖复合涂膜在红桔保鲜中的应用

余易琳，徐丹,2*，任丹,2，吴习宇,2

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400700)2(西南大学，食品贮藏与物流研究中心，重庆，400700)

柑橘果实产量丰富、风味可口、营养价值高，在全世界广受欢迎[1]。但果实在采摘之后由于呼吸、代谢、蒸腾等作用，在贮藏过程中会出现失重、软化、风味变差等品质劣化现象，并极易受微生物侵染而腐烂，导致严重的浪费和经济损失。在果实表面涂敷可食性涂膜，可在其表面形成阻隔层，在抑制其呼吸和蒸腾作用的同时，减轻果实的机械损伤，减少微生物侵染[2-3]。与化学保鲜法相比，具有绿色环保、安全高效等特点，因此受到了广泛关注。

壳聚糖(chitosan，CS)是自然界存量最丰富的多糖之一，具有良好的生物相容性、生物可降解性、成膜性、阻隔性以及抗菌性[4-5]，因此被认为是可食性涂膜保鲜的理想材料之一[6-8]。但CS吸湿性强、耐磨性差，在果实的呼吸和蒸腾作用下，结构易被破坏而失效。在CS基材中添加少量纳米粒子，可以改善其机械性能和气体阻隔性，从而提高CS涂膜的保鲜效果。常用的纳米粒子有纳米蒙脱土[9]、纳米氧化硅[10]、纳米银[11]和纳米二氧化钛[12]等。但这些无机纳米粒子对人体的毒性尚未明确，添加到包装材料中可能迁移到食品中从而造成安全风险[13-15]。纳米纤维素(nanocrystal cellulose，NCC)具有纤维素的骨架结构，无明显生物毒性，价格低廉[16]，具有良好的机械性能和生物相容性[17-18]。同时，NCC具有与CS相近的结构，因此与CS有很好的相容性，可在其中均匀分散。KHNA等[19]发现将一定量NCC加入CS薄膜中，可使薄膜的抗张强度提高26%，水蒸气透过率降低27%。因此，将NCC添加到CS复合涂膜中，有望改善复合涂膜的阻隔性和稳定性，从而影响其保鲜效果。目前，将NCC/CS复合涂膜用于柑橘的贮藏保鲜尚未见报道。因此，本研究在考察了NCC对CS独立膜的抗张性能和透过性能影响的基础上，将NCC/CS复合涂膜用于红桔保鲜，探究其对红桔在贮藏期间的腐烂率和各项品质指标的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

红桔：采于重庆市北碚区果园；壳聚糖：脱乙酰度为90%，相对分子质量为18万，潍坊海之源生物制品有限公司；NCC分散液：质量分数为1.05%，天津市木精灵生物科技有限公司；聚乙烯袋：14 cm×17 cm、厚度3 μm，浙江衢州市明利包装有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 独立膜的制备

将NCC分别按CS质量的0%、3%、6%和9%加入到体积分数为1.0%的冰醋酸水溶液中，搅拌20 min。称取一定量的CS分别加入上述NCC分散液中使CS浓度为15 g/L。持续搅拌24 h得到均匀溶液后，超声处理30 min即制备得到不同NCC含量的NCC/CS复合膜液。将上述膜液过滤后静置24 h，称取45 g倒入边长为120 mm的方形塑料培养皿中，于40℃的烘箱中干燥16 h，制备得到独立膜，厚度为30～40 μm。CS独立膜记为CS-S，NCC含量为3%、6%和9%的NCC/CS复合独立膜分别记为3NCC/CS-S、6NCC/CS-S和9NCC/CS-S。

1.3 独立膜的表征

1.3.1 红外光谱(FTIR)

将复合膜液稀释后制得厚度约为1 μm的薄膜，采用红外光谱仪(Spectrum100，美国PerkinElmer公司)的透过模式扫描。扫描范围为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描16次。

1.3.2 抗张性能

参照GB/T 1040.3标准，采用电子拉力机(SCW-500，济南兰光机电技术有限公司)进行测试。夹具间距50 mm，拉伸速度50 mm/min。每组膜至少测试10个样品。

1.3.3 吸湿率

将独立膜烘至恒重，称重记为m1。在湿度为100%，温度为25 ℃的环境中平衡24 h后，立即称重记为m2，计算m2相对于m1增加的百分数。每组膜至少测试5个样品。

1.3.4 水蒸气透过系数(water vapor permeability，WVP)

参照GB/T 1037—1988标准(减重法)，采用水蒸气透过率测试系统(W3/060，济南兰光机电技术有限公司)进行测试。测定前将膜在相对湿度为70%，温度为25℃的环境中平衡24 h。测试条件为相对湿度70%，温度25℃。

1.3.5 氧气透过率(oxygen permeability，OP)

参照GB/T 1038—2000标准，采用压差法气体渗透仪(VAC-V2，济南兰光机电技术有限公司)进行测试。测试条件为相对湿度48%，温度25℃。

1.4 红桔保鲜效果测定

1.4.1 红桔涂膜处理

在当天采摘的红桔中选取成熟度、质量和大小一致的果实。清水洗净后，用体积分数为70%的酒精擦拭橘皮消毒。常温晾干后随机分为5组，每组约100个果实。对照组不再进行任何处理，记为CK。涂膜组分别在CS膜液和NCC浓度为3%、6%和9%的NCC/CS复合膜液(NCC粉末质量分数为CS的3%、6%和9%)中浸泡2 min，取出后自然风干，分别记为CS、3NCC/CS、6NCC/CS和9NCC/CS。CS膜液和NCC/CS复合膜液的制备方法与1.2中独立膜的膜液制备方法相同，自然晾干后，涂膜厚度为1～5 μm。将聚乙烯袋预先用直径为6 mm的打孔器均匀打孔8次，然后放入各组果实进行单果包装。对每个果实称重，并记录下初始质量m0。置于温度为(8±3)℃，湿度为(75±10)%的环境中贮藏。每3 d从每组中随机取出9个无损鲜果测定其品质指标。

1.4.2 腐烂率

观察各组红桔果实，当果实的果皮表面出现任何霉菌、腐烂、病斑或者果皮软化呈水渍状，即视其为烂果。记录每组中烂果的数量，计算其占初始数量的百分数。

1.4.3 失重率

称量当日果实质量mt，按式(1)计算失重率Δm：

(1)

1.4.4 硬度

小心去除果皮后，在果实赤道部位均匀取3点，置于TA-XI2i质构仪(SMS公司)P/50探头下进行测试。探头预压速度2.00 mm/s，下压速度1.00 mm/s，压后上行速度5.00 mm/s，两次压缩间停顿3.0 s。三点测得的平均值记为该果实硬度。每组测定9个果实样品。

1.4.5 可溶性固形物(total soluble solids，TSS)

将去皮后的果肉榨汁，纱布过滤得到果汁。采用阿贝折射仪测定果汁的TSS，结果以%表示。

1.4.6 可滴定酸(titratable acid，TA)

采用酸碱滴定法测定。取上述过滤后的果汁10 mL用去离子水稀释至100 mL，取10 mL用质量分数为1%的NaOH溶液滴定直至出现粉红色，且30 s内不变色，记录下此时消耗的溶液体积，按式(2)计算果汁中的TA含量：

(2)

式中：N，NaOH溶液的摩尔浓度，mol/L-1；V，滴定样品消耗的NaOH溶液体积，L；Vs，样品体积，L；K，转换系数，以柠檬酸作标准，为0.064。

1.4.7 抗坏血酸(ascorbic acid，AA)

果汁中的AA含量参照秦海容等[20]的方法测定，结果以mg/100 mL表示。

1.4.8 丙二醛(malondialdehyde，MDA)

取1 mL过滤后的果汁，加入5 mL预冷的100 g/L三氯乙酸中提取20 min，然后取2 mL混合液加入2 mL质量分数为0.67%的硫代巴比妥酸溶液。在沸水浴中煮20 min，冷却后取上清液分别在450 nm、532 nm和600 nm处测定其吸光值，按公式(3)、(4)计算果汁中MDA的含量：

c/(μmol·L-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(3)

(4)

式中：c，丙二醛浓度，mol/L；OD450、OD532、OD600，分别为450 nm、532 nm、600 nm波长处的吸光度值；V，测定时样品的总体积，mL；m，样品质量，g。

1.4.9 总酚和类黄酮

称取0.5 g果皮组织，加入20 mL体积分数为1%的盐酸-甲醇溶液冷冻研磨后，在4℃环境下避光提取20 min，过滤。以1%盐酸-甲醇溶液作空白参比调零，测定滤液在波长280 nm和325 nm处的吸光度值。

1.5 数据处理

除特别指出外，每项测试中各组样品均重复测试3次，数据均采用平均值±均方差表示，并采用单因素ANOVA进行分析，用Duncan法进行多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 独立膜的表征

2.1.1 红外光谱分析

NCC冻干粉末、CS-S和6NCC/CS-S膜的红外光谱如图1所示。图中可观察到NCC的特征峰，如—OH的伸缩振动(3 200～3 600 cm-1)[21]，—CH和—CH2的伸缩振动(3 000～2 800 cm-1)与弯曲振动(1 500～1 250 cm-1)，C—O—C的伸缩振动(1 160 cm-1)[22]，以及—OH的面外弯曲振动(800 cm-1与650 cm-1)[23]。CS-S的特征峰主要为—OH和—NH2的伸缩振动(3 100～3 500 cm-1)，酰胺基I和酰胺基Ⅱ的弯曲振动(1 633 cm-1和1 538 cm-1)，C—O—C骨架的伸缩振动(1 235 cm-1)，C—O伸缩振动及—OH的弯曲振动(1 025～1 100 cm-1)。6NCC/CS-S的红外光谱图与CS-S较为接近，但在3 342 cm-1处出现了NCC的特征峰，说明了NCC的存在。3NCC/CS-S和9NCC/CS-S的红外光谱图与6NCC/CS-S相近，因此图中未给出。

图1 NCC冻干粉末、CS-S和6NCC/CS-S膜的红外光谱图

2.1.2 抗张性能

各独立膜的抗张性能如图2所示。当NCC的含量从3%增加至6%时，复合膜的抗张强度、断裂伸长率和杨氏模量相较于CS-S均显著增加。进一步增加NCC含量时，复合膜的抗张强度和断裂伸长率则有所降低。由此说明，添加的适量NCC可提高膜的拉伸性能。其中，与CS-S相比，6NCC/CS-S的抗拉强度、断裂伸长率和杨氏模量分别提高了60.15%、42.75%和21.49%。NCC作为高结晶度纳米纤维，具有很好的力学性能，且其含有的阴离子硫酸盐基团可与壳聚糖的阳离子胺基之间产生静电相互作用，有利于NCC在CS基质中均匀分散并进行良好的界面应力传递。因此，相较于CS-S，NCC/CS复合膜的抗张性能有着显著提升[24]。

A-抗张强度；B-断裂伸长度；C-杨氏模量

2.1.3 吸湿率和阻隔性能

由表1数据可看出，CS-S膜具有较好的氧气阻隔性，但水蒸气阻隔性较差，吸湿率高。添加3%的NCC使膜的吸湿率有所上升。但增加其含量后，复合膜的吸湿率显著下降，尤其是6NCC/CS-S，其吸湿率相较于CS-S下降了26%。这可能是该含量的NCC在CS基材中分散较好，与CS相互作用较强，减少了CS对水分子的吸附位点。但水蒸气透过系数的数据表明，添加3%的NCC可提高CS膜的水蒸气阻隔性，但继续增加NCC含量却无此效果。这可能是由于NCC和CS均为亲水性材料，在高湿度环境中二者的相互作用减弱[25]，因而NCC的影响不显著。与水蒸气透过系数不同，当NCC添加量为3%和6%时，复合膜的氧气透过率相较于CS膜无显著变化，而当其含量增加至9%时，复合膜对氧气的阻隔性显著提高。

表1 NCC含量对独立膜的吸湿率、水蒸气透过系数和氧气透过率的影响

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 涂膜对红桔的保鲜效果

2.2.1 红桔的腐烂率和失重率

红桔果实在贮藏期间的腐烂率如图3-A所示。各组红桔均在贮藏至第9天时出现腐烂。其中CK组的腐烂率在贮藏后期上升很快，至第15天时，腐烂率已达38.0%。而相同贮藏时间，涂膜组的腐烂率则明显低于CK组，而复合涂膜组的腐烂率相较于CS涂膜组又进一步降低。尤其是6NCC/CS组，在15 d时的腐烂率相较于CK组降低了60.5%。随着贮藏时间的延长，果实衰老程度逐渐增加，细胞和组织的完整性受到破坏，因此更容易受到微生物浸染[25]。CS涂膜可在果实表面形成一层致密的阻隔层，从而调节果实的呼吸作用并起到防止微生物侵染的作用，因此可显著降低果实的腐烂率。但CS是一种亲水且脆性的材料，果实表面的CS涂膜在贮藏期间可能发生结构破坏从而导致效果减弱[7]。从单膜的表征结果可看出，NCC的添加可提高复合膜的抗张性能，从而增强其结构稳定性。因此，添加了NCC的复合涂膜对果实腐烂率的抑制效果更为显著和持久。在第12天时，涂膜果实相较于对照组更为饱满，且表皮由于涂膜而具有较高的光泽度，尤其是NCC/CS复合组光泽度更高。

蒸腾是指水从果实内部释放到果皮，最终以气态形式从果实表面蒸发的现象，由果实的组织结构和气孔行为来调节[12]。由图3-B中的数据可看出，CS组的失重率与CK组无显著差异，说明亲水性的涂膜材料对果实蒸腾作用的抑制效果不明显[26]。同样，添加了NCC的涂膜组，除3NCC/CS组在0～12 d的失重率显著高于其他组外，其余组的失重率均与CK和CS组无显著差异。而独立膜的表征结果也显示，CS-S、6NCC/CS-S和9NCC/CS-S的水蒸气透过系数间无显著性差异。

A-腐烂率；B-失重率

2.2.2 红桔的硬度、可溶性固形物、可滴定酸和抗坏血酸的变化

如图4-A所示，在贮藏过程中各组果实的硬度有一定的波动，总体趋势是随贮藏时间的延长而降低。CK组的果实硬度在6 d后迅速下降；在贮藏15 d时，其硬度低于所有涂膜组，表明涂膜能够有效抑制果实的软化。已有研究表明，可食性涂膜可在果实内部维持低O2、高CO2含量的气氛环境，从而抑制乙烯的生成，降低细胞壁降解酶的活性，因此有利于果实硬度的保持[27]。

如图4-B所示，TSS含量在整个贮藏期间呈波动性变化。TSS作为糖的主要组成成分，在果实的呼吸过程中被消耗转化为CO2和H2O，造成TSS含量的一定下降。同时，果实中的细胞壁水解产生多糖，淀粉水解造成单糖含量的增加，失水导致果实内部干物质含量的上升，会造成TSS含量上升[28]。涂膜给果实的表面提供了半阻隔性，降低了其呼吸速率，抑制了TSS分解。因此，在贮藏12 d后，CK组的TSS含量显著低于涂膜组。

酸是果实呼吸作用的重要基质，随着果实在贮藏过程中不断呼吸消耗，其含量逐渐降低，导致果实糖酸比与风味出现变化。如图4-C所示，各组果实的TA含量均随贮藏期延长而降低。同时，除第9天外，CK组的TA含量与涂膜组相比均呈较低水平。这可能是由于涂膜降低了果实的呼吸速率，从而降低了其对酸的消耗，维持了较高的TA含量。

AA是果蔬的基本营养物质，与抗氧化性和酶辅助因子相关，能有效清除多种活性氧(ROS)，释放半脱氢抗坏血酸，还原硫自由基[29]。如图4-D所示，各组果实的AA含量均呈先上升后缓慢降低的趋势。但在整个贮藏期间，CK组的AA含量上升速率较慢且总体低于涂膜组。而涂膜组尤其是含NCC的涂膜组在贮藏前3 d，AA含量迅速上升至较高水平而后缓慢下降。其中，6NCC/CS组在贮藏期间均能保持较高且稳定的AA含量。AA含量增加可能是由于果实的采后成熟过程、生物合成、氧化和再循环系统[30]等作用造成。但是贮藏过程中果实的抗氧化过程也会消耗AA。因此，果实中AA含量在贮藏期间产生波动是AA的生物合成和消耗共同作用的结果。涂膜果实具有较高的AA含量可能与其较低的呼吸速率导致较少的消耗有关。而果实中较高的AA含量，有利于增强果实的抗氧化作用，从而延缓果实衰老。

A-硬度；B-可溶性固形物；C-可滴定酸；D-抗环血酸

2.2.3 红桔的丙二醛、总酚和类黄酮含量的变化

果蔬的衰老与活性氧代谢平衡(即活性氧产生与清除的动态平衡)密切相关， 活性氧过量会导致膜脂过氧化，对细胞膜产生严重的伤害，从而导致果实衰老。为测定膜脂在氧化应激下的完整性，以MDA作为膜损伤的直接指标，其含量越高，表明植物抵御外界逆境的能力越弱。如图5-A所示，各组果实的MDA含量均随贮藏时间的延长而增加。贮藏至第9天，MDA含量迅速上升，且CK组上升速度最快，显著高于涂膜组(P<0.05)。而涂膜组中，6NCC/CS组的MDA含量在第9天后均显著低于其他组。由此说明，复合涂膜对果实MDA的积累有具有明显的抑制作用，有效抑制果实中活性氧的产生，延缓膜脂过氧化。

果蔬中的酚类和黄酮类化合物具有直接清除活性氧的作用，可对抗脂质氧化，提高机体的抗氧化酶活性，减少果实内部过氧化物的形成[26]。如图5-B和5-C所示，各组红桔中的总酚与类黄酮含量均呈先上升后下降又略有上升的趋势。同时，在贮藏初期，涂膜组的类黄酮和总酚含量的上升幅度均高于CK组。而在贮藏15 d后，CK组的总酚与类黄酮含量仍然显著低于涂膜组(P<0.05)，说明涂膜组果实能更好地抵抗衰老。

A-丙二醛;B-总酚;C-类黄酮

在贮藏12 d以后，含NCC复合涂膜组的丙二醛含量均显著低于CS组，而类黄酮和总酚含量则显著高于CS组。独立膜表征结果可知，添加NCC可提高CS膜的机械性能，降低其吸湿性。由此可推断相较于CS涂膜，复合涂膜的稳定性提高，因此在贮藏后期对红桔的保鲜效果更为显著。

3 结论

本研究首先制备了CS以及NCC/CS复合的独立膜并对其进行了表征，发现NCC的添加有助于提高独立膜的抗张性能，降低其吸湿率，从而有助于提高其结构稳定性。然后，将CS和NCC/CS复合涂膜用于红桔保鲜。结果表明，虽然涂膜对红桔在贮藏期间的失重率无显著抑制效果，但能够很好地降低其腐烂率。相较于CS涂膜，添加了NCC复合涂膜对红桔腐烂的抑制效果更为显著，尤其是6NCC/CS组的腐烂率在整个贮藏期间均保持较低水平。同时，涂膜还有利于保持红桔的硬度，维持较高的TA和AA含量，缓解果实的膜脂过氧化，减少总酚和类黄酮的流失，从而保持果实品质，延缓衰老和腐烂的发生。因此，可通过在CS涂膜中添加NCC，改善涂膜的阻隔性和稳定性，从而进一步降低红桔的腐烂率，提高其贮藏品质。后期将进一步探讨NCC/CS复合涂膜和柑橘果实的相互作用关系，以阐明其涂膜保鲜机理。