榨菜腌制过程中变红或产膜现象相关微生物的分离鉴定

杨吉霞，张玉礼，王学锦，贺稚非*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400716)2(重庆市涪陵榨菜集团股份有限公司，重庆, 408000)

涪陵榨菜采用茎瘤芥(Brassicajuncea，俗称青菜头)腌制加工，是世界三大名腌菜之一[1-2]。榨菜加工工艺包括3次腌制和3次压榨：第1次腌制采用菜块质量分数2%～4%的食盐腌制约7 d，第2次加入4%～8%食盐腌制20～30 d，第3次以10%左右食盐用量腌制4～6月，每次腌制结束时都将榨菜起池、压榨去水[3]。

榨菜腌制过程中偶尔出现菜块表面变红，或者表面有一层膜的现象，有时引起菜块变软甚至腐败。目前对引起菜块变红、产膜现象的原因不清楚。本研究采集变红、产膜的菜块样品，分离鉴定相关的微生物，并且用Illumina Miseq测序鉴定原料表面的微生物种类，分析是否来源于青菜头原料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验原料

用无菌操作采集变红的榨菜样品4个，编号为H1～H4(图1-A)，采集有膜的样品5个，编号为M1～M5(图1-B)。

A-变红；B-产膜

1.1.2 实验试剂

酵母与霉菌培养基(yeast maltose，YM)、MRS、营养肉汤(nutrient broth, NB)、平板计数(plate count agar,PCA)培养基，青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、酵母基因组DNA提取试剂盒(DP307)、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)，天根生化科技(北京)有限公司；DNeasy mericon Food Kit (69514)，德国Qiagen公司；琼脂糖Regular agarose G-10，西班牙BIOWEST；1×TE缓冲液(B548106-0500)、50×TAE缓冲液(B548101)、PBS缓冲液(pH 7.3～7.5，B640435)，生工生物工程(上海)股份有限公司；Premix Taq、RNase-free water、DL2 000 DNA ladder marker，宝生物工程(大连)有限公司。

引物：本研究所用引物如表1所示，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.1.3 仪器与设备

JJ1000 电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；303-4B电热恒温培养箱，上海叶拓仪器仪表有限公司；HBM-400D拍击式均质仪，天津市恒奥科技发展有限公司；BX43F 生物显微镜，OLYMPUS；T100 PCR仪、Power pacbasic电泳仪，美国Bio-Rad公司；SW-CJ-2F洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；G:BOXEF凝胶成像系统，美国gene公司；P100/P100+超微量分光光度计，美国Pultton公司；Mini-Q超级纯水仪，法国Synergy公司。

1.2 实验方法

1.2.1 榨菜变红或产膜相关菌株的分离纯化和形态学鉴定

变红的榨菜样品：取变红部位，加入无菌均质袋中，加入已灭菌50 mL PBS缓冲液，用拍击式均质仪均质1 min，溶液用0.22 μm滤膜过滤，用接种针挑取滤膜上的微生物分别在添加80 g/L NaCl的YM、MRS、NB、PCA培养基上划线分离，于(30±1)℃培养3 d，选出红色菌落的菌株，经过至少连续3次划线分离，得到纯化的菌株，将菌株接种在已灭菌的榨菜中，每株菌接种3份榨菜，另设1组作为空白对照，于(30±1)℃培养，观察是否出现变红现象，如果变红，再从此榨菜上分离纯化得到纯菌株，鉴定其性状是否与接种的菌株相同[8]。

产膜的榨菜样品：用接种针挑取菜块上的膜，分别在添加80 g/L NaCl的YM、MRS、NB、PCA培养基上划线分离，于(30±1)℃培养3 d，经过至少连续3次划线分离，得到纯化的菌株，将菌株逐一接种到适宜的液体培养基中培养48 h，如果在培养液表面形成菌膜，将菌株接种在已灭菌的榨菜中，每株菌接种3份榨菜，另设1组作为空白对照，于(30±1)℃培养，观察是否出现产膜现象，如果产膜，再从此榨菜上分离纯化得到纯菌株，鉴定其性状是否与接种的菌株相同。

将变红和产膜菌株用适当的培养基培养，观察菌落形态，做革兰氏染色，观察显微形态并且拍照。

1.2.2 菌株的分子生物学鉴定

利用天根公司细菌或者酵母基因组DNA提取试剂盒提取分离微生物的基因组DNA。通过PCR扩增细菌16S rDNA序列、酵母菌26S rDNA序列，25 μL PCR反应体系包括2×Premix Taq buffer (TAKARA) 12.5 μL、前后引物(10 μmol/L)各0.8 μL、DNA 2 μL、ddH2O 8.9 μL；扩增程序为：94 ℃预变性3 min，30个循环(94 ℃变性40 s，适宜的温度退火40 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。其中细菌的引物为27F和1492R，退火温度为57 ℃[4]；真菌的引物为NL1和NL4，退火温度为54 ℃[6-7]。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察条带并且拍照。将PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化后，送生工生物(上海)有限公司测序，测序结果通过NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对鉴定，并用MEGA7.0软件进行系统发育分析。

1.2.3 菌株产酶实验

将酪蛋白或者可溶性淀粉以10 g/L的量加入培养基中，接种菌株，(30±1)℃培养48 h，采用平板水解圈法初步检测菌株是否产生蛋白酶或者淀粉酶。

1.2.4 Illumina MiSeq法分析青菜头原料表面微生物的种类

取原料堆中不同部位的青菜头10颗，用灭菌的PBS溶液清洗青菜头表面，洗液用0.22 μm滤膜过滤，用20 mL 灭菌的PBS溶液充分洗下滤膜上的微生物，用DNeasy mericon Food Kit试剂盒按照说明书的步骤提取微生物的宏基因组DNA[9]。用338F和806R引物扩增16S rDNA的V3-V4可变区，PCR反应体系和程序与“1.2.2”相同，退火温度为55 ℃[5]。经过验证的宏基因组DNA送上海美吉生物医药科技有限公司，采用Illumina MiSeq PE300平台对16S rDNA的V3-V4可变区进行高通量测序，测序引物为338F和806R，长度为468 bp[5]。

将获得的序列采用QIIME软件包(quantitative insights into microbial ecology，定量分析微生物群落，version 1.7)[10]进行生物信息分析。采用UCLUST软件在97%的相似度水平下对序列进行聚类分析，获得分类操作单元(operational taxonomic units，OTUs)[11]，将序列基于Silva(silva128/16s_bacteria，https://www.arb-silva.de/documentation/release-128/)[12-14]细菌数据库进行比对，分类置信度0.7，得到每个OTU对应的物种分类信息，生成不同分类水平上的物种丰度表。用R绘制样品在属水平下的物种构成图。部分数据分析在上海美吉生物医药科技有限公司的I-Sanger云平台中完成(https://www.i-sanger.com/)。

1.2.5 NCBI序列号

本研究中菌株的16S rDNA序列均上传至NCBI的GenBank，变红相关菌株的序列注册号为MN445590至MN445593，产膜相关菌株的序列注册号为MN445594至MN445606。青菜头原料样品表面微生物的16S rDNA V3-V4序列存入NCBI 的Sequence Read Archive (SRA) 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，BioProject ID为PRJNA565341。

2 结果与分析

2.1 榨菜变红或产膜现象相关菌株的菌落形态和显微形态鉴定

本研究从变红榨菜样品中分离、纯化、验证得到4株引起变红现象的菌株，其菌落形态和显微形态如表2和图2所示。从产膜榨菜样品中鉴定出引起产膜现象的菌株有13株，其菌落形态和显微形态如表2和图3所示，图4为部分菌株产膜验证实验照片。

表2 榨菜变红或产膜现象相关菌株的菌落形态和显微形态

a-h1-1;b-h2-1;c-h3-1;d-h4-1

a-m1-1;b-m1-2;c-m2-1;d-m3-1;e-m3-2；f-m3-3;g-m3-4;h-m3-5;i-m4-1;j-m4-2;k-m5-1;l-m5-2,m-m5-3

a-m1-1;b-m2-1;c-m3-1;d-m4-1

2.2 榨菜变红或产膜现象相关菌株的分子生物学鉴定

4株变红相关菌株和13株产膜菌株的基因组DNA均采用27F和1492R引物PCR扩增成功，用NL1和NL4引物扩增没有条带，所以菌株均为细菌。将菌株的16S rDNA序列输入NCBI blast网页中比对鉴定菌种，其结果如表3所示，菌株m4-1与参考序列的query coverage(覆盖度)为99%，percent identity(序列相似度)为99.48%，综合分析它与参考序列的相似度为98.49%，其余菌株与参考序列的相似度均大于99%。通常认为菌株间16S rDNA基因序列同源性大于97%很可能属于同一个种[15-16]，根据NCBI比对结果列出了序列相似性最高的种。

图5为用MEGA7.0软件构建的榨菜变红现象相关菌株16S rDNA序列的进化树图，待测菌株的16S rDNA序列均与相应的参考序列正确聚类，验证了菌种鉴定的合理性。图6为产膜现象相关菌株的系统进化树图，除了Bacillusamyloliquefaciens与Bacillusvelezensis的待测菌株和参考序列聚集在同一个分枝之外，其余菌种单独聚为一个分枝，并且待测菌株的序列均与相应的参考序列正确聚类。WANG等的文献报道Bacillusamyloliquefaciens与Bacillusvelezensis的16S rDNA序列相似度达到99.7%，在构建的系统进化树中也聚集为一个分支[17]，与本研究结果一致。

表3 菌株在NCBI blast网页中比对鉴定结果

图5 榨菜变红现象相关菌株的16S rDNA序列进化树图

图6 榨菜产膜现象相关菌株的16S rDNA序列进化树图

2.3 菌株产酶活性

能够产生蛋白酶(即水解酪蛋白)的菌株包括h1-1、h3-1、m1-1、m1-2、m2-1、m3-1、m3-3、m3-4、m4-1、m4-2、m5-2、m5-3。能够产生淀粉酶(即水解可溶性淀粉)的菌株包括h1-1、h3-1、h4-1、m1-1、m2-1、m3-1、m3-2、m3-4、m3-5、m4-2、m5-2、m5-3。部分菌株的产酶实验如图7所示。

a～e-m3-1、m1-2、m3-1、m4-1、m5-2(产蛋白酶实验)；f～j-h1-1、m2-1、m3-2、m4-2、m5-2(产淀粉酶实验)

2.4 青菜头原料表面微生物种类鉴定

采用Illumina Miseq对青菜头原料表面微生物DNA的16S rDNA基因V3-V4区段进行高通量测序，鉴定细菌的种类构成，总共产生了53 624条raw reads, 平均序列长度为447.58 bp，Coverage 1.000，测序深度满足生物信息学分析要求。鉴定出OTU总数为173，门、纲、目、科、属、种数量分别为：7、12、29、52、91、132。最优势的属为Pseudomonas(62.54%)，其他优势属(相对丰度>1%的)还包括：unclassified_f_Enterobacteriaceae(6.34%), norank_c_Cyanobacteria(6.34%)，Erwinia(3.80%)，Acinetobacter(2.79%)，Janthinobacterium(2.70%)，Duganella(2.67%)，Chryseobacterium(2.61%)，Flavobacterium(2.34%)(见图8)。从青菜头原料中没有鉴定出芽孢杆菌属(Bacillus)，然而细菌群落中存在很低丰度的Rhodococcus(0.184 8%)和Staphylococcus(0.026 4%)，没有鉴定到种的水平，如表4所示。由此可初步推测，引起变红现象的嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)和引起产膜现象的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有可能来源于青菜头原料。

图8 青菜头原料表面细菌在属水平的种类构成图

表4 从青菜头原料中鉴定出的Staphylococcus和Rhodococcus属信息统计

3 讨论

本研究鉴定出引起榨菜变红的菌种包括嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)3种。YOON等[18]将1株降解吡啶的菌株鉴定为嗜吡啶红球菌，革兰氏阳性球菌，菌落为橙色，与本研究中分离鉴定的嗜吡啶红球菌形态一致。郑晓冬等分析得出红球菌色素是类胡萝卜素，非单一色素[19]。TAKAICHI等的文献也指出红球菌属的色素为类胡萝卜素[20]。由此可推测，嗜吡啶红球菌可能因为产类胡萝卜素而使菌落呈橙(红)色。目前比较少文献报道Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis的菌落为红色。

本研究鉴定出产膜菌株种类包括：解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillusvelezensis)、阿耶波多氏芽孢杆菌 (Bacillusaryabhattai)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。现有的文献EP映证了这7种菌都能形成生物膜[21-27]。芽孢杆菌属的菌体在温度、pH值、营养、或者菌体自身产生的胞外DNA、信号肽等条件的诱导下，吸附在固体表面，繁殖形成微菌落，菌体进一步生长并分泌大量的胞外多聚物(多糖、蛋白质或者核酸)，将菌体细胞包被并聚集在一起，形成成熟的生物膜，菌体的运动功能相关基因表达下调，失去运动能力，以维持生物膜的稳定性。生物膜的形成有利于增强菌体对不良环境的耐受性[23-26]。表皮葡萄球菌形成生物膜主要经过2个阶段：菌体首先在蛋白质AtIE(具有黏附玻连蛋白活性)和Fbe(可能与宿主的纤维蛋白原结合)的帮助下黏附于固体表面，然后在PIA和AAP蛋白介导下相互聚集，形成成熟的生物膜[27]。在产膜相关菌种中，蜡状芽孢杆菌和表皮葡萄球菌是机会病原菌，蜡状芽孢杆菌的部分菌株产生毒素，引起腹泻或呕吐[28]；表皮葡萄球菌是医院感染(伤口或者血流感染)的重要菌种之一[29]。

变红和产膜相关菌株大多产生淀粉酶或蛋白酶。涪陵青菜头原料的蛋白质含量高达5 800 mg/500 g，总糖含量为4 300 mg/500 g，菌株可能通过产生酶降解原料中的蛋白质或糖类成分引起榨菜腐败。

本研究采用高通量测序法分析了青菜头表面细菌的种类构成，结果显示葡萄球菌属(Staphylococcus)和红球菌属(Rhodococcus)以很低的丰度存在，没有发现芽孢杆菌属。由此推测，引起变红现象的嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)和引起产膜现象的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有可能来源于青菜头原料，芽孢杆菌属菌株的来源有待进一步分析。

4 结论

本研究鉴定出与榨菜变红现象相关的菌株有4株，包括3个菌种：嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。

本研究鉴定出引起榨菜产膜的菌株有13株，包括7个菌种：解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillusvelezensis)、阿耶波多氏芽孢杆菌 (Bacillusaryabhattai)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。

嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有可能来源于青菜头原料。