苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用的研究

安欢，叶云，丁华杰，朱云婷，钟英英

(广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006)

苦瓜(MomordicacharantiaL.) 是一种药食两用的植物，其营养价值丰富，具有清热解毒、养颜嫩肤和降血糖等功效，而苦瓜作为一种天然的“苦”味觉调味品，不仅可以作为日常食用瓜果，苦瓜粗提取物也含有类似胰岛素物质，具有明显的降血糖功效。且其降血糖、抗肿瘤及增强免疫活性等功效引起了国内外学者的关注[1]。

目前，肥胖已经成为全球性的健康问题。研究表明，肥胖的特征在于脂肪量的增加，脂肪组织功能发生障碍的原因是脂肪细胞的增生和肥大[2]。抑制体内胰脂肪酶活性可有效地抑制脂肪储存，调节脂肪细胞增殖、分化和新陈代谢。因此，胰脂肪酶抑制剂的研究受到了科研工作者的广泛关注[3]。本研究探讨了苦瓜多糖对胰脂肪酶活性抑制作用的影响，通过酶动力学分析考察其对胰脂肪酶抑制类型，为苦瓜的综合利用提供了新的途径。

1 材料

苦瓜：购自广西柳州冠超市，切片、烘干、粉碎后过40目标准筛得到苦瓜粉末。胰脂肪酶(活力≥30000 U/g)：上海源叶生物科技有限公司；磷酸氢二钠、邻苯二甲酸氢钾：广东省化学试剂工程技术研究中心；三油酸甘油酯：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇等其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 苦瓜多糖的提取

根据参考文献[4-6]稍作修改，采用热水浸提法来提取苦瓜多糖：苦瓜粉末用80%乙醇回流浸提2次，每次2 h，除去杂质，真空抽滤回收乙醇，滤渣烘干待用。称取 10.000 g预处理的苦瓜粉末，90 ℃水浴加热按照料液比为 1∶20回流4 h，趁热抽滤后合并滤液。苦瓜多糖浸提液真空浓缩至原体积的1/5，加入 5倍体积的 80%乙醇进行醇沉 12 h 析出多糖，醇沉液离心后洗涤滤饼，40 ℃条件下干燥至恒重后得到的固体即为苦瓜粗多糖。

2.2 苦瓜多糖含量的测定

用紫外分光光度计在340～600 nm 范围内进行扫描，确定苦瓜多糖的最大吸收波长[7]。在最大吸收波长处分别测出不同浓度的葡萄糖溶液的吸光度。利用葡萄糖浓度(mg/mL)对吸光度值作标准曲线，求出线性方程[8]。测定样品吸光度，根据吸光度值标准曲线计算出苦瓜多糖含量。

2.3 胰脂肪酶活性试验

参照褚盼盼等[9]的研究方法，对胰脂肪酶的活性进行检测，平行试验3次，空白试验除了加入95%乙醇和加入酶液两个步骤相互调换之后，其他步骤同上[10]。

胰脂肪酶活力(UI)=1000×(V样-V空)×c/tw 。

式中：c为NaOH溶液的浓度，mol/L；w为胰脂肪酶取样量，g；t为反应时间，min。

2.4 不同反应条件下苦瓜多糖对胰脂肪酶活力抑制影响

2.4.1 不同浓度的苦瓜多糖对胰脂肪酶活性的抑制

配制5份浓度分别为10，20，30，40，50 mg/mL的苦瓜多糖溶液，分别吸取5 mL放于不同锥形瓶中，按照测定胰脂肪酶活性试验的方法，求出不同浓度的苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率[11]。

2.4.2 不同 pH 对胰脂肪酶活性的抑制

结合2.4.1的试验结果，对苦瓜多糖抑制率达到最大浓度条件，配制pH为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的5组磷酸缓冲液，计算不同pH的苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率。

2.4.3 不同反应时间对胰脂肪酶活性的抑制

设定5个不同的反应时间分别为5，15，25，35，45 min，结合2.4.1和2.4.2两个步骤，选择最佳苦瓜多糖浓度和最适pH，计算不同反应时间的苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率。

2.4.4 不同温度对胰脂肪酶活性的抑制

设置5个不同的反应温度20，25，37，50，60 ℃，结合2.4.1、2.4.2和2.4.3 3个步骤得出的试验结果，在最佳苦瓜多糖浓度、反应时间，最适pH的条件下，按照测定胰脂肪酶活性试验的方法，求出不同反应温度的苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率。

2.5 半抑制浓度IC50的测定

按照胰脂肪酶活性试验，得出最佳反应条件，即磷酸缓冲液pH为7.5，反应时间为15 min，反应温度为37 ℃，以此条件测定不同浓度的苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率，绘制回归曲线，得出半抑制浓度IC50[12]。

2.6 抑制作用类型的测定

选择胰脂肪酶最佳抑制率条件，为检测苦瓜多糖在10，20，30，40，50 mg/mL的浓度时对脂肪的分解速度。采用2组检测液，每组的聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液添加量各不同。并且以反应速度的倒数为纵坐标，苦瓜多糖浓度为横坐标，绘制Dixon图，求出苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制常数Ki[13]。比较不同浓度底物的反应对苦瓜多糖含量的影响，采用Lineweaver-Burk双倒数模型进行绘图。

3 结果与分析

3.1 苦瓜多糖含量的测定

3.1.1 最大吸收波长

图1 苦瓜多糖在不同波长处吸光度曲线图Fig.1 Absorbance curve of Momordica charantia polysaccharide at different wavelengths

由图1可知，波长在 340～440 nm时，吸光度值曲线处于较平缓状态，当波长继续增大时吸光度值出现大幅度的上升趋势，当波长处于487 nm时，苦瓜多糖的吸光度值最大，因此苦瓜多糖的最大吸收波长为487 nm。

3.1.2 葡萄糖标准工作曲线的制备

图2 葡萄糖在不同波长处吸光度曲线图Fig.2 Absorbance curve of glucose at different wavelengths

由图2可知，当波长为487 nm时葡萄糖的吸光度值在特征光谱吸收中最为明显，因此选择在此波长下测定葡萄糖的标准工作曲线。

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 Standard curve of glucose

由图3可知，由葡萄糖标准工作曲线图可得到回归方程为y=0.2169x+0.2201，R2=0.9987，因此葡萄糖浓度在0.4～4.8 μg/mL范围内呈良好线性关系。

3.2 不同反应条件下苦瓜多糖对胰脂肪酶活力的抑制特性研究

3.2.1 不同浓度的苦瓜多糖对胰脂肪酶活性的抑制

图4 不同浓度的苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide with different concentration on pancreatic lipase

由图4可知，苦瓜多糖浓度从10 mg/mL逐渐增加到50 mg/mL时，对胰脂肪酶的抑制率呈现先升后降的趋势，脂肪酶受抑制作用随着浓度增大越来越明显，浓度达到30 mg/mL时抑制率达到最大值，为51.24%，继续增大浓度，抑制率降低，因为此时苦瓜多糖与脂肪酶的结合达到饱和的状态，酶促反应速率降低。

3.2.2 不同pH的苦瓜多糖对胰脂肪酶活性的抑制

图5 不同pH下苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase at different pH values

由图5可知，不同的pH条件下苦瓜多糖对胰脂肪酶r 抑制作用有所不同， pH为5.5时抑制率最低，随着pH的不断增大，pH为7.5时抑制率达到最大，但随后pH的增大抑制作用反而逐渐减弱。原因可能是胰脂肪酶在强酸强碱的条件下，酶的构象易发生改变，导致其活性损失[14]。在中性略偏碱性时，酶活性最高，对胰脂肪酶的抑制率最大。动物体内酶的最适pH一般在6.5～8.0范围内，酶的活性受pH影响，过酸过碱都会使酶蛋白变性失活，从而影响到脂肪的水解。

3.2.3 不同反应时间的苦瓜多糖对胰脂肪酶活性的抑制

图6 不同反应时间下苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of Momordica charantia on polysaccharide pancreatic lipase at different reaction time

由图6可知，反应时间在2～15 min范围内，抑制率随着反应时间的延长不断增高，说明苦瓜多糖与胰脂肪酶的结合需要一定时间，随着时间的继续延长，苦瓜多糖与胰脂肪酶结合达到饱和，抑制率随之降低。也可能是苦瓜粗提物中含有的苦瓜蛋白能与酶蛋白作用生成生成物导致蛋白沉淀，降低酶活性，其相互作用随着反应时间的加长而不断增加，使胰脂肪酶的活性降低。因此可以得出苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制的最佳反应时间为15 min。

3.2.4 不同反应温度的苦瓜多糖对胰脂肪酶活性的抑制

图7 不同反应温度下苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase at different reaction temperatures

由图7可知，胰脂肪酶活性受温度影响波动较明显，当温度处于37 ℃时酶活力达到最大值45.6%。低温会抑制酶的活性，相反，温度过高，超过60 ℃时酶分子的构象发生改变从而变性，导致酶催化活力大幅度下降。胰脂肪酶一般都是从哺乳动物体内提取，哺乳动物体内正常温度一般为37 ℃，得出37 ℃为苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用的临界温度。

3.3 半抑制浓度IC50的测定结果

图8 最佳反应条件下不同浓度苦瓜多糖 对胰脂肪酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of Momordica charantia polysaccharide with different concentration on pancreatic lipase under the optimum reaction conditions

由图8可知，苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用的多项式方程为：y=-0.0463x2+3.3969x-11.202，R2=0.9865，故苦瓜多糖浓度为30 mg/mL时抑制率最佳，对胰脂肪酶抑制作用的半抑制浓度为29.86 mg/mL。虽然苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率并不高，但其半抑制浓度较高，原因可能是在苦瓜多糖浓度较低时，多糖与底物结合率也较低，胰脂肪酶对其灵敏性相对迟钝。

3.4 抑制作用类型的测定结果

苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用的Dixon和Lineweaver-Burk图见图9和图10。

图9 苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用Dixon图Fig.9 Dixon diagram of the inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase

由图9可知，添加不同量底物时，不同浓度苦瓜多糖对其反应速度的影响曲线交点的绝对值为21.62，胰脂肪酶的抑制常数Ki=21.62 mg/mL<50 mg/mL，得出苦瓜多糖对脂肪酶的抑制作用较强。

图10 苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用Lineweaver-Burk图Fig.10 Lineweaver-Burk diagram of the inhibitory effect of Momordica charantia polysaccharide on pancreatic lipase

由图10可知，改变底物浓度，样品组加入苦瓜多糖，对照组不加苦瓜多糖，得到底物浓度倒数与反应速度倒数曲线相交，符合非竞争性抑制的特征[15]。因此得出苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制作用是非竞争性抑制，底物浓度并不会影响苦瓜多糖与胰脂肪酶的结合率。

4 结论

苦瓜因其独特的苦味常被用作一种调味品，因其丰富的营养价值受到人们的关注，在烹制某些食品时略加一点苦味调味品，会使菜肴有一种特殊的香鲜滋味，刺激人的食欲。

本文主要研究苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用的影响，在不同的反应条件下测出苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率，并进一步分析其对胰脂肪酶的抑制类型及抑制常数。经过试验结果分析得出得苦瓜多糖的最大吸收波长为487 nm，吸光度最大，对胰脂肪酶的最佳抑制条件为：苦瓜多糖浓度为30 mg/mL，反应时间为15 min，pH为7.5，反应温度37 ℃，该条件下苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制率达到51.24%。苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制类型测定结果显示：苦瓜多糖对胰脂肪酶的抑制常数为21.62 mg/mL，抑制类型为非竞争性抑制，对胰脂肪酶的抑制作用明显。苦瓜多糖对胰脂肪酶抑制作用也受其他因素的影响，有待进一步研究。

在最佳抑制条件下测定结果表明，苦瓜多糖对胰脂肪酶有明显的抑制作用，因此将苦瓜多糖开发为一种减肥药物具有潜在的市场前景，此外，苦瓜多糖的抗菌、抗氧化和抗肿瘤等功效有待进一步的研究与应用。