红糖HPLC-DAD指纹图谱与化学模式识别

陈其钊，陈红香*，陈嘉敏，王桂华，李家威，余构彬

(1.广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)，广东省甘蔗改良与生物炼制 重点实验室，广州 510316；2.国家糖业质量监督检验中心，广州 510316)

红糖是以甘蔗为原料经压榨、“连环锅”熬煮、石灰澄清、过滤除杂、蒸发浓缩、搅拌起晶后形成的非分蜜糖。因没有经过高度精练，红糖营养成分比白砂糖高很多，由于其除糖外还含有维生素和微量元素，如铁、锌、锰、铬等[1,2]。《本草纲目》中记载：沙糖性温，和脾缓肝。中医认为，红糖性温、味甘、入脾，具有益气补血、健脾暖胃、缓中止痛、活血化瘀的作用，尤其适合年老体弱、大病初愈、月经不调的人群以及产妇食用[3,4]。日本美容医生认为，含有红糖成分的面膜的美容效果比流行的激光祛斑、果酸换肤等更好[5]，因其蕴含的胡萝卜素、核黄素、烟酸、氨基酸、葡萄糖等成分对细胞有强效抗氧化及修护的作用，能预防黑色素生成，持续美白等。红糖中的一些酚类物质和抗氧化物质还可以清除自由基，维护细胞的正常功能和新陈代谢[6]。此外，其中还含有某些可以有效调节体内各种色素代谢过程的天然酸类和色素调节物质。

现代指纹图谱技术应用于鉴定、溯源、质量控制工作，主要原理是将研究对象的指纹图谱和对照指纹图谱进行相似性评价，即比较两者间的差异性和共性，从而实现质量控制等目的[7]。通过指纹图谱的特征性，能更有效甄别样品；通过对指纹图谱的共有峰进行对比监控，能有效控制样品的质量，确保样品质量的相对稳定。指纹图谱应用于中药鉴定领域的技术体系已比较成熟，现也逐渐应用于食品鉴别领域中，目前应用比较多的是茶叶、食用菌、调味料以及肉类这几类食品的品质鉴定上[8-16]，准确度、可靠度、可行性都比较高。

本试验采用高效液相色谱法，建立了21批红糖样品的指纹图谱，并结合聚类分析和主成分分析为红糖产品进行综合评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸：分析纯；甲醇、乙腈：色谱纯，默克公司；pH计：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；旋转蒸发仪：德国IKA公司；e2695高效液相色谱仪：美国沃特世公司。

21批次红糖样品均来自2017-2019年广东、广西、云南3个不同产地的企业的送检(见表1)。

表1 红糖样品来源Table 1 The source of brown sugar samples

续 表

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：MYCOTOXTM反相C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：A 0.1 mol/L磷酸二氢钠(pH 2.3)∶B乙腈为98∶2，等度洗脱。检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.2 供试品溶液的制备

称取10 g样品，以无水乙醇100 mL作为提取溶液，搅拌，至完全溶解(约30 min)，用滤纸过滤，去掉不溶物，将滤液置于鸡心瓶中于40 ℃旋干，得到固体。将得到的干燥固体以超纯水做溶剂，配制成10 mg/mL的待测溶液，以0.22 μm微孔滤膜过滤，得到供试液溶液。

1.3 HPLC指纹图谱的方法学考察

1.3.1 精密度试验

取同一批次红糖样品溶液(编号：S1)，连续进样6次，选取9号色谱峰为参照峰。计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值。

1.3.2 重复性试验

取同一批次红糖样品溶液(编号：S1)共6份，按1.2.1项下色谱条件分别测定，记录保留时间和峰面积。

1.3.3 稳定性试验

取同一批次红糖样品溶液(编号：S1)，分别在0,2,4,6,8,12,24 h，按1.2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图。

2 结果与分析

2.1 红糖指纹图谱的测定

指纹图谱方法学考察表明无论精密度试验、重复性试验还是稳定性试验，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明精密度、重复性、稳定性良好，符合指纹图谱研究的技术要求。

分别取不同厂家的21批红糖样品，按1.2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录各批次供试品溶液的全波长指纹图谱并对21批次红糖样品的紫外色谱指纹图谱相关参数进行比较，对样品中峰面积较稳定且各样品中共有的色谱峰进行标定。

2.2 指纹图谱共有模式的建立

将得到的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012年版)，对选定的HPLC图谱进行多点校正，自动匹配，建立不同产地红糖HPLC指纹图谱，并计算相似度值，结果见图1、图2和表1。其中出峰时间基本一致、峰面积相对较大的13个色谱峰被设为特征共有峰，9号峰的分离度较好并且峰形对称，所以选择其为参照峰。21批样品共有峰相对保留时间、相对峰面积范围见表2。

图1 21批红糖样品HPLC-PDA色谱指纹图谱Fig.1 HPLC-PDA fingerprint spectra of 21 batches of brown sugar samples

图2 红糖的HPLC-PDA对照指纹图谱Fig.2 HPLC-PDA control fingerprint spectra of brown sugar

表2 21批样品共有峰的相对峰面积Table 2 Relative peak area of common peaks of 21 batches of samples

2.3 指纹图谱的相似度评价

由表1可知，不同产地红糖的指纹图谱相似度在0.480～0.985之间，说明不同产地的红糖所含的化学成分和质量有一定的区别。红糖的质量分级是以总糖分作为指标，从相似度看，不同等级红糖间的图谱整体面貌基本一致，个别样品比较突出，说明产品质量受产地、气候、生态环境及厂家生产工艺的影响。

2.4 聚类分析

将21批不同产地的红糖样品13个共有峰相对峰面积导入SPSS 19.0软件进行系统聚类，采用组间联接法，以欧氏距离(Euclidean Distance)作为样品分类依据对其进行系统聚类分析，得到聚类树状图，见图3。

图3 聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

由图3可知，当类间距离大于20时，21批红糖样品聚为A，B两大类，其中A类分为A1类和A2类，S8、S9、S10、S12、S13、S14、S18聚为A1类，S1、S4、S5、S6、S7、S11、S15、S16、S17、S19、S21聚为A2类，S2、S3、S20聚为B类。

2.5 主成分分析

本试验将21批样品的13个共有峰峰面积导入SPSS 19.0软件，计算相关系数矩阵、特征值和方差贡献率，进行主成分分析，并将特征值大于1的成分提取出来，得到数个主成分，结果见表3和表4。

表3 特征值与贡献率Table 3 Eigenvalues and contribution rates

表4 旋转后公共因子载荷矩阵Table 4 Public factor loading matrix after rotation

由表3可知，前3个主成分特征值大于1，对方差的累积贡献率为85.593%，因此可见红糖的多个成分可以简化为3个主成分进行分析。载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大。由表4可知，峰4和峰10在主成分1上有较高的载荷，峰1和峰2在主成分2上有较高的载荷，峰6在主成分3上有较高的载荷(载荷绝对值大于0.8)。

2.6 综合质量评分

由表5可知，S21样品主成分因子综合得分最高，该批样品中成分 3,4,5,7,9,10,12,13的含量相对较高，整体质量相对较好。

2.7 OPLS-DA

偏最小二乘法是一种化学计量学统计方法，广泛应用于代谢组学中，其所建立的数学模型能对“多靶点、多成分和整体作用”的研究对象的化学成分和生物活性物质之间的联系进行有效分析[18，19]。

将3个产地的红糖指纹图谱中标定的13个共有峰的峰面积导入SIMCA-P 14.0软件中进行分析，建立的模型的R2为0.74，Q2为0.481，为了进一步分析，将3个产地进行两两对比，作OPLS-DA分析得到的得分图，见图4～图6。

图4 广东-广西红糖OPLS-DA分析得力图Fig.4 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Guangxi Province

图5 广东-云南红糖OPLS-DA分析得力图Fig.5 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Yunnan Province

图6 广西-云南红糖OPLS-DA分析得力图Fig.6 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangxi-Yunnan Province

由图4～图6可知，不同产地的成分构成模式大致可以区分开。

根据主成分分析结果，选出了两个主成分，依据离原点越远的点对分组贡献越大的原则，结合由OPLS-DA分析得到的变量投影重要性指标(VIP)值，见表6。

表6 3个产地的红糖OPLS-DA分析的VIP值表Table 6 VIP values of OPLS-DA analysis of brown sugar in three producing areas

找出3个产地红糖差异性组分。由表6可知，与产地广东相比，产自广西的红糖在保留时间为5.825，6.43，7.51，16.54，29.30 min的成分有差异，产自云南的红糖的保留时间为7.512,10.40 min的成分有差异，产地广西与产地云南相比，差异成分为保留时间6.43,9.22,16.54 min的成分。这些差异成分是区分3个不同产区红糖质量的主要指标性物质(但由于缺少标准品的对照，暂时无法对相关物质进行确认)。

3 讨论

采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行紫外全波长扫描，结果发现在210 nm波长以下有最大吸收，由于接近末端吸收，所以选择210 nm波长作为检测波长，在此波长下色谱图基线噪音较低，各峰的保留时间适中，分离度较好，基线稳定，有利于指纹图谱分析。红糖中的糖分很高，而且没有紫外吸收，浓缩时会使供试液很粘稠而影响测定，因此利用蔗糖、葡萄糖、果糖这类物质在乙醇中的溶解度低，而非糖组分如有机酸类、氨基酸类、酚类等物质能溶于乙醇的特点，选择无水乙醇作为提取溶剂。此外，通过对磷酸氢二铵-乙腈、磷酸-乙腈、磷酸二氢钠-乙腈3个流动相系统(等度洗脱)进行考察，结果只有磷酸二氢钠-乙腈系统各峰分离度比较好；进一步优化后发现，以乙腈-0.1 mol/L磷酸二氢钠水溶液洗脱效果最好，出峰数最多，基线平稳，各峰分离度均达到分离要求。

本次试验通过多点校正得到了21批红糖指纹图谱以及对照图谱，通过数据对比可知21批红糖基本相似，含量有差别，该指纹图谱对红糖产品的溯源、质量控制及功效成分的研究具有参考价值。

将3个产地的红糖非糖组分的13个共有峰的数据导入SIMCA-P软件进行主成分分析，分析3个产地的共有物质的含量模式相似情况，寻找主要差异成分。经PLS-DA验证模型有效后，通过OPLS-DA分析得到变量投影重要性指标(VIP)值可知，3个产地之间的差异组分主要是保留时间为5.82,6.43,7.51,16.54,29.30,9.22,10.40 min对应的物质。这些差异组分均未知，需要结合质谱等手段进一步确定。

由指纹图谱对比分析和主成分分析结果可知，不同产地红糖组分的构成和含量均存在差异，这种差异可能是由不同产地甘蔗的生长环境气候、土壤以及生产工艺造成的。因此，可以通过建立指纹图谱的方法，对未知样品进行指纹图谱比对，从而实现溯源的目的。