基于LAMP技术检测纯芝麻酱中的多种植物源性成分

谢文佳，石盼盼，陈蕾 ，李轲

(1.河南省产品质量监督检验院，郑州 450047；2.郑州海关技术中心，郑州 450003)

芝麻酱也叫麻酱，由炒熟的芝麻磨碎制成，味道鲜美，营养丰富，是一种深受消费者喜爱的香味调味品。但是，出于追求超额利润的需要，部分不法商人可能在芝麻酱中掺入其他油料作物成分，不仅给消费者带来了经济损失，甚至危害消费者的身体健康[1]。目前，芝麻酱的掺假一般通过检测芝麻酱中脂肪酸的种类和含量、特征风味物质[2，3]，或者利用分子生物学技术检测目标物特异性DNA序列进行鉴定[4,5]。

环介导恒温扩增技术(loop -mediated isothermal amplification，LAMP)是一种分子生物学技术检测目标物特异性DNA序列的新方法。该方法利用4 条特异性引物识别靶基因上的6个特定区域和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下进行扩增反应，扩增效率可达108～1010 kb/min，反应扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜结构的双链DNA片段混合物。

本文根据芝麻、花生、葵花籽的特异性基因序列设计特异性引物，建立了芝麻酱中芝麻、花生、葵花籽源性成分的LAMP检测方法，并应用该方法对市售的41份纯芝麻酱样品进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：41种纯芝麻酱样品均随机购自超市，芝麻、花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麦、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麦、芸豆、大麦、黑豆等购自超市或农贸市场。

主要试剂：植物DNA提取试剂盒、大豆内源核酸检测试剂盒、玉米内源核酸检测试剂盒、水稻内源核酸检测试剂盒、DNA扩增试剂盒(恒温扩增法SR01-24，含酶)、植物内源核酸检测试剂盒，均购自广州迪澳生物科技有限公司；内引物、外引物和环引物由赛默飞世尔科技上海工厂合成。

1.2 主要仪器

LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪：美国罗氏公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取

DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒，按照使用说明书要求进行制备和提取，提取后均采用植物内源核酸检测试剂盒进行LAMP扩增，出现典型的“S”型曲线说明提取的DNA符合要求。

1.3.2 引物设计

分别选择芝麻2S Albumin、花生Arah2.01、葵花籽HaG5基因，使用Primer ExploerV4 (http：//primer exlorer.jp)设计相应的的特异性引物，分别包括2条外引物F3和B3、2条内引物FIP和BIP以及2条环引物FLP和BLP(花生无环引物)。引物DNA序列见表1，由赛默飞世尔科技上海工厂合成。

表1 LAMP扩增的引物Table 1 Primers for LAMP amplification

续 表

1.3.3 LAMP扩增反应

按照DNA扩增试剂盒(恒温扩增法SR01-24，含酶)说明书内“实时荧光法”所示步骤使用荧光定量PCR仪进行LAMP反应，反应体系见表2。

表2 LAMP扩增的反应体系Table 2 The reaction system of LAMP amplification

反应条件为：63 ℃，30 s； 63 ℃，15 s；63 ℃，45 s；共60个循环。

1.3.4 引物特异性试验

分别提取芝麻、花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麦、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麦、芸豆、大麦、黑豆15种农作物样本的DNA作为模板，用超纯水代替DNA模板做阴性对照，以芝麻特异性引物进行LAMP扩增反应，验证引物对芝麻源性成分检测的特异性。同样地，分别采用花生、葵花籽特异性引物进行LAMP扩增，验证引物对花生、葵花籽源性成分检测的特异性。

1.3.5 灵敏度试验

以花生、葵花籽、大豆(质量比1∶1∶1)的充分混合物为基体，制成含芝麻质量百分比分别为5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超纯水代替DNA模板做阴性对照，进行LAMP扩增，确定芝麻源性成分的检测灵敏度。

以芝麻、葵花籽、大豆(质量比1∶1∶1)的充分混合物为基体，制成含花生质量百分比分别为5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超纯水代替DNA模板做阴性对照，进行LAMP扩增，确定花生源性成分的检测灵敏度。

以芝麻、花生、大豆(质量比1∶1∶1)的充分混合物为基体，制成含葵花籽质量百分比分别为5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超纯水代替DNA模板做阴性对照，进行LAMP扩增，确定葵花籽源性成分的检测灵敏度。

1.3.6 对市售41个芝麻酱样品6种植物源性成分的检测

从超市随机购买41瓶芝麻酱，应用上述方法分别对这些样本中的芝麻、花生、葵花籽源性成分进行检测，并分别使用大豆内源核酸检测试剂盒、玉米内源核酸检测试剂盒、水稻内源核酸检测试剂盒对大豆、玉米、水稻源性成分进行检测，以调查市场上芝麻酱的真伪情况。

2 试验结果

2.1 芝麻源性成分的检测

2.1.1 引物的特异性检测

根据芝麻2S Albumin基因所设计的内、外引物及环引物对芝麻DNA有显著扩增，而对其他14种植物样本DNA均无扩增，说明该引物对芝麻源性成分检测具有良好的特异性，见图1。

图1 芝麻源性成分LAMP特异性扩增结果Fig.1 LAMP specific amplification results of sesame-derived components

注：0为阳性对照；1为芝麻；2～15为花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麦、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麦、芸豆、大麦、黑豆；16为阴性对照。

2.1.2 芝麻源性灵敏度测定

从含芝麻质量百分比分别为5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA为模板进行LAMP扩增反应，都产生了明显的荧光反应曲线，与之相对的阴性对照未检测到扩增反应(见图2)，因此该LAMP反应能够检测低至0.1%的混合物中芝麻源性成分的存在。

图2 芝麻源性成分LAMP扩增灵敏度检测结果Fig.2 Detection results of LAMP amplification sensitivity of sesame-derived components

注：0为阳性对照；1～4为5%、1%、0.5%、0.1%；5为阴性对照。

2.2 花生成分的检测

2.2.1 引物的特异性检测

根据花生Arah2.01基因所设计的内、外引物对花生DNA有显著扩增，而对其他14种植物样本DNA均无扩增，说明该引物对花生源性成分检测具有良好的特异性，见图3。

图3 花生源性成分LAMP特异性扩增结果Fig.3 LAMP specific amplification results of peanut-derived components

注：0为阳性对照；1为花生；2～15为芝麻、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麦、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麦、芸豆、大麦、黑豆；16为阴性对照。

2.2.2 花生源性灵敏度测定

从含花生质量百分比分别为5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA为模板进行LAMP扩增反应，都产生了明显的荧光反应曲线，与之相对的阴性对照未检测到扩增反应(见图4)，因此该LAMP反应能够检测低至0.1%的混合物中花生源性成分的存在。

图4 花生源性成分LAMP灵敏度检测结果Fig.4 LAMP sensitivity test results of peanut- derived components

注：0为阳性对照；1～4为5%、1%、0.5%、0.1%；5为阴性对照。

2.3 葵花籽成分的检测

2.3.1 引物的特异性检测

根据葵花籽HaG5基因所设计的内、外引物及环引物对葵花籽DNA有显著扩增，而对其他14种植物样本DNA均无扩增，说明该引物对葵花籽源性成分检测具有良好的特异性，见图5。

图5 葵花籽源性成分LAMP特异性扩增结果Fig.5 LAMP specific amplification results of sunflower seed-derived components

注： 0为阳性对照；1为葵花籽；2～15为花生、芝麻、大豆、水稻、玉米、燕麦、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麦、芸豆、大麦、黑豆；16为阴性对照。

2.3.2 葵花籽源性灵敏度测定

图6 葵花籽源性成分LAMP灵敏度检测结果Fig.6 LAMP sensitivity test results of sunflower seed-derived components

注：0为阳性对照；1～4为5%、1%、0.5%、0.1%；5为阴性对照。

从含葵花籽质量百分比分别为5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA为模板进行LAMP扩增反应，都产生了明显的荧光反应曲线，与之相对的阴性对照中未检测到扩增反应(见图6)，因此该LAMP反应能够检测低至0.1%的混合物中葵花籽源性成分的存在。

2.4 市售41个芝麻酱样品6种植物源性成分的检测结果

市售41份芝麻酱样本中全部检出芝麻源性成分；检出花生源性18例，占比为43.90%；检出葵花籽源性成分1例，占比为2.43%；检出大豆源性成分2例，占比为4.89%；水稻源性和玉米源性成分均未检出。

3 讨论

环介导恒温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种较为新型的体外DNA扩增技术，该方法克服了荧光定量PCR技术需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，大大节省了反复升降温的时间，可实现在恒温条件下进行连续的快速扩增，不需要复杂、昂贵的温控和辅助设备；同时，该方法不需合成价格昂贵的探针，但仍然具有高度的反应特异性。因此，LAMP技术是一种更为准确、简便，能够适应大批量样本的现场快速鉴定的技术，已在临床病原微生物检测、遗传病诊断、SNP分型、传染病监测和转基因食品鉴定等领域显示出了巨大的应用潜力并正得到日益广泛的应用。

本文建立了一套利用LAMP技术进行芝麻酱中芝麻、花生、葵花籽源性成分的检测方法，能够在60 min内检测低至0.1%的混合物中芝麻、花生、葵花籽源性成分的存在，具有良好的特异性，对芝麻酱掺假的鉴别有重要的实用价值。从本次市场抽取41个纯芝麻酱的检测结果发现，市售芝麻酱产品掺入花生、葵花籽、大豆等成分冒充纯芝麻酱的现象比较普遍。