小茴香挥发油提取工艺优化及抗氧化研究

马延红，孙侨生，段志芳，刘文华

(肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061)

小茴香(FoeniculumvulgareMill.)为伞形科茴香属多年生草本植物茴香的干燥成熟果实，具有散寒止痛、理气和胃的功效[1]，是《中国药典》收载的一味传统中药，也常作为调味品和香料使用，主要含有挥发油、生物碱、黄酮、脂肪酸、甾醇和糖苷等多种类型的化合物[2]。

挥发油是小茴香的主要有效成分之一，也是发挥生理活性的重要物质基础[3]。主要是单萜类化合物和苯丙烷类化合物，反式茴香脑作为小茴香挥发油的主要成分，相对含量可达到65%～80%[4]。此类化合物存在于小茴香内，具有强烈的茴香香味，并可随水蒸气挥发[5,6]。水蒸气蒸馏法具有操作简便、成本低、无溶剂残留等优点[7]，且对挥发油中的微量成分提取效率高，可以得到绝大部分的挥发性香气成分[8]，在小茴香挥发油提取方法中占据优势，是目前提取小茴香挥发油的主要方法。但水蒸气蒸馏法的提取效率容易受到物料粉碎粒度、料液比、浸泡时间、提取时间等多种因素的影响。因此，本试验以小茴香为原料，采用水蒸气蒸馏法研究不同提取条件对小茴香挥发油提取率的影响，确定最佳提取工艺，为小茴香精油的产业化生产提供一定的参考。同时，利用体外抗氧化试验测定小茴香精油的总还原能力、羟自由基清除率和DPPH清除率，评定其体外抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小茴香：广州市清平药材市场；抗坏血酸标准品：广东光华科技股份有限公司；DPPH：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA124S-CW型电子天平 赛多利斯公司；Q-800D型高速万能粉碎机 上海冰都电器有限公司；DK-98-II型电炉 天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小茴香挥发油提取工艺优化

1.3.1.1 小茴香挥发油提取流程

将小茴香粉碎、过筛，加入浸提剂，用水蒸气蒸馏法(依据试验设计选择不同的粉碎粒度、料液比、浸泡时间和蒸馏时间)提取小茴香挥发油。经水油分离、无水硫酸钠除水后，密封保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.1.2 单因素试验

本试验选取不同的料液比、粉碎粒度、浸泡时间和蒸馏时间等因素进行单因素试验。

料液比的确定：准确称取10 g小茴香粉末，过20目筛，分别加入150，200，250，300 mL蒸馏水作提取溶剂，固定粉碎粒度为20目，浸泡时间为0 h，蒸馏时间为3 h，在以上条件下提取小茴香挥发油。

粉碎粒度的确定：准确称取10 g小茴香粉末，分别过20，50，60，100目筛，加入250 mL蒸馏水作提取溶剂，固定料液比为1∶25，浸泡时间为0 h，蒸馏时间为3 h，在以上条件下提取小茴香挥发油。

浸泡时间的确定：准确称取10 g小茴香粉末，过20目筛，加入250 mL蒸馏水作提取溶剂，分别浸泡0，1，2，3 h后提取，固定料液比为1∶25，粉碎粒度为20目，蒸馏时间为3 h，在以上条件下提取小茴香挥发油。

蒸馏时间的确定：准确称取10 g小茴香粉末，过20目筛，加入250 mL蒸馏水作提取溶剂，固定料液比为1∶25，粉碎粒度为20目，浸泡时间为0 h，分别蒸馏3，4，5，6 h，在以上条件下提取小茴香挥发油。

1.3.1.3 正交试验

利用正交试验设计优化小茴香挥发油的提取工艺，在以上4个单因素试验中，选择溶剂料液比、物料粉碎粒度、浸泡时间和蒸馏时间进行四因素三水平正交试验。

1.3.2 抗氧化活性的测定

1.3.2.1 DPPH法

称取不同量的挥发油于50 mL的容量瓶中，用95%乙醇将样品配制成0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同浓度的样品溶液，将1 mL上述药液加入2 mL浓度为0.5 mmol/L的DPPH 溶液，室温遮光放置30 min，反应完全后，于517 nm波长处测其吸光度，每个试样做3个平行样，取平均值。用对应浓度的抗坏血酸作为阳性对照组，并以抗坏血酸浓度和自由基清除率做标准曲线。样品结果以每克样品中所含抗坏血酸相当量来表示[9]。

DPPH清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

式中：A0为未加药时DPPH溶液的吸光度；A1为抗坏血酸溶液或样品溶液加DPPH溶液的吸光度。

1.3.2.2 总还原能力的测定

采用铁氰化钾还原法[10]。称取0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同浓度的小茴香挥发油溶液各1 mL加入试管中，依次加入2.5 mL的PBS溶液和2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6，混匀，于50 ℃恒温水浴20 min，加入10% 三氯乙酸溶液2.5 mL，用转速为3000 r/min的离心机离心10 min，取上清液2.5 mL，再加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，室温放置10 min后，于700 nm波长下测其吸光度，每个试样做3个平行样，取平均值。以与药液同样浓度的抗坏血酸作为阳性对照。

1.3.2.3 羟自由基清除率[11]

取5支10 mL试管，分别加入0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL不同浓度的小茴香挥发油溶液，再依次向各试管中加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，摇匀后，室温静置10 min。再向各试管中加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，摇匀，置于50 ℃恒温水浴30 min，于510 nm波长下测定其吸光度，每个样品测3个平行样，取平均值。以与药液同样浓度的抗坏血酸作为阳性对照，并以抗坏血酸浓度和自由基清除率做标准曲线。样品结果以每克样品中所含抗坏血酸相当量来表示。

羟自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式中：A0为95%乙醇溶液的吸光度；A1为抗坏血酸溶液或样品溶液的吸光度；A2为用95%乙醇代替水杨酸时样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比的确定

不同比例的料液比对小茴香挥发油提取率的影响见图1。

图1 不同料液比对小茴香挥发油提取率的影响Fig.1 Effect of different ratios of solid to liquid on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由图1可知，当料液比为1∶15～1∶30，挥发油提取率呈现先上升后下降的趋势，且当料液比为1∶25时，挥发油的得率最大。因此，选择料液比1∶20、1∶25、1∶30 3个水平进行下一步正交试验。

2.1.2 粉碎粒度的确定

不同粉碎粒度对小茴香挥发油提取率的影响见图2。

图2 不同粉碎粒度对小茴香挥发油提取率的影响Fig.2 Effect of different crushing particle size on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由图2可知，在20，50，60，100目条件下，粉碎粒度对小茴香挥发油提取率的影响较小，当粉碎粒度为60目时，挥发油得率最大。选择50，60，100目3个水平进行正交试验。

2.1.3 浸泡时间的确定

挥发油提取过程中，浸泡与否及浸泡时间长短会影响挥发油的得率。不同浸泡时间对小茴香挥发油提取率的影响见图3。

图3 不同浸泡时间对小茴香挥发油提取率的影响Fig.3 Effect of different soaking time on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由图3可知，当浸泡时间分别为0，1，2，3 h时，挥发油提取率呈先上升后下降的趋势，但变化较平稳，且在浸泡时间为2 h时，挥发油得率最大。选择1，2，3 h 3个水平进行下一步正交试验。

2.1.4 蒸馏时间的确定

不同蒸馏时间对小茴香挥发油提取率的影响见图4。

图4 不同蒸馏时间对小茴香挥发油提取率的影响Fig.4 Effect of different distillation time on extraction rates of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

由图4可知，当蒸馏时间为3，4，5，6 h时，小茴香挥发油提取率呈缓慢上升趋势，且当蒸馏时间为6 h时，挥发油得率最大。因此，选择4，5，6 h 3个水平进行正交试验。

2.2 正交试验设计及结果

正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 小茴香挥发油提取工艺因素水平Table 1 The factors and levels of extraction process of volatile oils from Foeniculum vulgare Mill.

表2 小茴香挥发油提取正交试验设计与结果分析Table 2 Orthogonal test design and results analysis of volatile oils extraction from Foeniculum vulgare Mill.

以挥发油得率为指标，由表2可知，在小茴香挥发油提取过程中，各因素对挥发油得率的影响大小依次是A>D>C>B，即蒸馏时间>粉碎粒度>浸泡时间>料液比。正交试验结果表明，小茴香挥发油提取的最佳工艺条件是A3B2C1D3，即蒸馏时间为6 h，料液比为1∶25，浸泡时间为1 h，粉碎粒度为100目时，结果最优。结合试验中的挥发油提取率结果，证实了在该组合条件下，挥发油得率为3.6412%，优于其他试验组合。

2.3 体外抗氧化活性测定结果

2.3.1 清除DPPH自由基和羟自由基的能力

通过测定小茴香挥发油对DPPH自由基的清除率和对羟自由基的清除率，评价其体外抗氧化活性。研究结果表明，小茴香挥发油具有较好的体外抗氧化活性，见表3。

表3 小茴香挥发油清除自由基能力Table 3 The ability of Foeniculum vulgare Mill. volatile oils to scavenge free radicals

小茴香挥发油的抗氧化能力以Vc当量来表示，由表3可知，在0.4，0.8，2.0，4.0，8.0 mg/mL浓度下，小茴香挥发油对自由基清除率(DPPH法)用Vc相当量表示分别为7.9，20.0，31.8，53.5，80.0 mg/g；对羟自由基清除率用Vc相当量表示分别为60.5，36.2，35.8，44.3，48.2 mg/g。

2.3.2 总还原能力

总还原能力的测定是利用样品的抗氧化性，将赤血盐还原后，再与Fe3+作用，生成普鲁士蓝，以普鲁士蓝的生成量表示样品的还原能力，并以吸光度值来表示，吸光度值越高，说明样品的还原能力越强[12]。

图5 小茴香挥发油与抗坏血酸总还原能力的比较Fig.5 Comparison of total reducing capacity between volatile oils of Foeniculum vulgare Mill. and ascorbic acid

由图5可知，小茴香挥发油的还原能力与浓度呈正相关关系，浓度越高，还原能力越强。以抗坏血酸为阳性对照，以此来评价小茴香挥发油的总还原能力。

3 结论

通过单因素试验和正交试验方法优化水蒸气蒸馏法提取小茴香挥发油的提取工艺，最佳提取条件为：蒸馏时间为6 h，料液比为1∶25，浸泡时间为1 h，粉碎粒度为100目。在此条件下提取小茴香挥发油，出油率为3.6412%。并采用3种体外抗氧化活性检测方法(DPPH法、羟自由基清除率、总还原能力测定)评价小茴香挥发油的抗氧化活性，结果表明：小茴香挥发油具有一定的抗氧化性，且浓度与其抗氧化活性基本呈现正相关性。本研究通过优化小茴香挥发油的提取工艺，为小茴香挥发油的加工生产和科学合理利用提供了一定的理论基础。小茴香挥发油的抗氧化活性研究对于天然食品来源的抗氧化剂和保鲜剂的开发利用提供了理论依据和支持[13]。同时，小茴香不管是作为常用中药还是日常调味品，都在人们的生活中占据着重要地位。通过研究小茴香挥发油的体外抗氧化活性对于深入探究其药用价值具有重要的科学意义。